このプロトコルは、焦点てんかんの最も一般的な原因であるWC5遺伝子のノックダウンの影響を迅速に評価する方法を提供する。この技術の主な利点は、発達の様々な段階で行動と生理学的特徴の両方を使用して表現型のようなてんかんを評価するためにそれを使用できることです。マイクロインジェクションの前日、ゼブラフィッシュの交配タンクを設置する。
注射の朝、分社を取り除いて産卵を有効にします。細かいふるいを使用して、卵を胚の水で満たされた100ミリメートルのペトリ皿に移します。プラスチック製のパスツールピペットを使用して、60〜80個の卵を選び、注射のためにシリコーンコーティングされたペトリ皿に卵を配置します。
私たちは水のほとんどを動かし、卵を半分に覆うのに十分なままです。ガラスの針を注射液のチューブに垂直に入れます。数分間にわたって毛細血管作用によってチューブを充填するために着色された溶液を許可します。
注射液が針先に見える場合は、マイクロインジェクタの注入ハンドルに針を取り付け、空気圧縮機をオンにします。圧力設定を調整して、2ナノリットルの射出量を生成します。そして、4倍の倍率で、解剖双眼顕微鏡の下に卵を配置する。
絨毛膜と単段胚の黄身を通して針先を挿入し、各細胞内に直接溶液を注入する。その後、注入した胚を胚水のラベル付き100ミリメートルペトリ皿に移し、プレートを摂氏28度のインキュベーターに入れます。受精後28時間、テスト皿の底にプラスチック1.2、1.2ミリメートルのメッシュグリッドを置きます。
プラスチック製のパスツールピペットを使用して、その子の内部に10〜12個の胚をプラスチックメッシュに配置します。胚を水没させ続けるのに十分な胚水で皿を満たし、浮遊せず、必要に応じてプラスチックチップで胚をグリッド上の位置に慎重に移動させます。次に、解剖顕微鏡に取り付けられたビデオカメラを使用して、10〜20分間の自発的な巻き取り活動を記録する。
自発的な動きの合計を分析するには、Zebraラボシステムの活動定量モジュールを使用して、記録されたビデオをアップロードし、必要に応じて各胚の周りの追跡アリーナを設計します。フリーズとバーストのしきい値をそれぞれ 10 と 50 に設定します。そして、自動ビデオ分析時に、定義された各アリーナ内の総アクティビティを定量化します。
次に、適切なデータ解析ソフトウェアを使用して、分析を実行するためのスプレッドシートとしてデータセットを回復します。受精後46時間、微細な鉗子を使って胚をデコリオ化し、130ミリメートルの試験皿を胚水で満たす。残りの15分前に、28°Cのインキュベーターでテスト皿を温めます。
タッチ呼び起こされる脱出応答テストを実行するには、プラスチック製のパスツールピペットを使用して、テスト皿の中央、カメラの下に胚を配置します。1 秒あたり 30 フレームの取得レートを使用して、記録を開始します。細かいプラスチックチップを使用して、わずかにフリックモーションで胚の尾部に触れます。
幼虫がその動きを終了したとき、記録を停止します。次に、胚を新鮮な胚水で満たされた新しい保持皿に移し、実験条件ごとに必要な数の胚で試験を繰り返す。電気生理学的分析のためにゼブラ魚を準備するには、ガラス底のペトリ皿に受精後1、4〜6日を置きます。
魚ができるだけ皿の底に近づくことを確実にするために、余分な、余分なセーラーミディアムを取り除きます。プラスチック製のパスツールピペットを使用して、幼虫を覆うのに十分な暖かい液体アグロを追加します。アグロはハードネスながら、細かい鉗子を使用して、魚の腹側を皿の中央に下向きにします。
次に、2ミリリットルの記録溶液を加え、10ミクロモルパンクロニウム臭化物を含む臭化物を皿に入れて、神経筋伝達を遮断する。次に、マイクロピペットを記録溶液で充填し、電圧クランプ構成でパッチクランプアンプを使用して、その正しい値を確認するために浴内の電極抵抗を測定する。20xの目的を使用して、幼虫の頭部を中央視野に置き、マイクロピペットを下げて、視テクタム内の記録位置に到達します。
パッチクランプアンプを現在のクランプ構成に切り替え、保持電流をゼロミリアンペアに固定します。1キロヘルツのローパスフィルターと1キロヘルツの取得率、および10のデジタルゲインを使用して、魚の自発的な活動を60分間記録して、ベースライン活動レベルを決定します。ベースライン記録の終わりに、1リットル当たり300ミリモルの1リットルの143マイクロリットルで、1リットル当たり20ミリモルの最終濃度を得た。
ペンチレンテトラゾール溶液で動物の神経活動をさらに120分間記録する。記録のベースライン期間中、受精後4〜6日のてんかんモデルシマウマ魚は自発的な事象のより高い発生を示し、ミスマッチコントロール魚は非常に少ない変動を示す。ペンチレンテトラゾール適用後、ミスマッチ制御とてんかんモデルシマウマ魚の両方が深い偏光事象の増加を示す。
ペンチレンテトラゾール塗布後の最初の期間において、ミスマッチ制御とノックダウン動物の両方で毎分0.8のイベントの割合が観察され、大部分のイベントが高振幅である。後者の応答期間中。分極解除の割合は、1 分あたり約 1 つのイベントに増加します。
そして、イベントの大半は低振幅です。ノックダウンを行う場合、用量応答曲線を用いてモルフォリノスの正しい用量を確立し、非特異的毒性を回避するための制御を行うことが非常に重要です。このプッシュは、遺伝的または化学的な修飾剤の効果をテストするなど、いくつかの下流の研究を可能にします。
そして、ゼブラフィッシュの行動と神経活動は、DC 5突然変異の発達効果を理解する。
