ヒト幹細胞由来GABA作動性ニューロンの生後早期マウス海馬への移植による神経発達障害緩和

このアプローチにより、健康な脳と病気の脳の発達において、移植された介在ニューロンの細胞同一性、統合、および機能を長期間にわたって調査することができます。このプロトコルは、ナイーブマウスとトランスジェニックマウスの海馬に生き残り、成熟する前駆体のようなヒト幹細胞由来のGABA作動性介在ニューロンの迅速かつ高効率な生成について説明しています。このアプローチは、介在ニューロンが損なわれている発達障害において細胞療法を使用することの治療の可能性を評価するのに役立ちます。

まず、ヒト由来の介在ニューロン前駆体から細胞培養培地を取り除き、カルシウムとマグネシウムを含まないDPBSで慎重にすすいでください。400マイクロリットルの細胞剥離溶液を6ウェルプレートの各ウェルに加える。細胞の境界が光沢のあるように見え始めるまで、インキュベーター内で摂氏37度で2〜3分間インキュベートします。

次に、6ウェルプレートの各ウェルに600マイクロリットルの新鮮なN2培地を加えて細胞剥離液を停止し、ピペットを使用して細胞を機械的に剥離して単一細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液をプラスチックチューブに移し、室温で180 Gで4分間遠心分離します。真空システムを用いて上清を廃棄し、ペレットを移植培地に再懸濁する。

計数チャンバーとタリーカウンターを使用して懸濁液中の全細胞をカウントし、マイクロリットルあたり100, 000細胞の最終濃度に容量を調整します。細胞懸濁液を、移植するまで氷上の密閉チューブに最大4時間保管します。麻酔の直後に、上肢が白っぽくなるまで3分間、湿った氷の表面の濡れたティッシュの上に子犬を置きます。

細胞をピペットで慎重に再懸濁し、シリンジに細胞懸濁液をロードします。子犬を定位固定装置フレームに置き、イヤーバーを反対方向に使用して配置します。次に、エタノールに浸した軟組織を使用して皮膚の表面をきれいにします。

ラムダを識別し、定位固定装置のデジタルディスプレイコンソールで座標をゼロに設定します。ハミルトンシリンジを目的の座標に移動した後、90度曲がったインスリン針を使用して頭蓋骨を貫通し、小さな穴を開けます。次に、針が頭蓋骨を横切るまでハミルトン注射器を下ろし、背腹座標をゼロにします。

希望の背腹座標が得られるまで針を下げます。幹細胞が注入されたら、針をゆっくりと引っ込めます。子犬が動き始めるまで手で温めてから、母親に返して手順を終了します。

Iba1、CD68、およびガレクチン-3を使用して同定された反応性ミクログリアがないことによって評価されるように、移植後14日目または移植後2か月のいずれにおいても、移植細胞に対する免疫反応または局所炎症は見られませんでした。アストログリオーシスの程度は、グリア原線維性酸性タンパク質およびインターロイキン-1などの炎症性サイトカイン、ならびに細胞傷害性リンパ球の不在によって決定される。Cntnap2ノックアウトマウスでは、ヒト幹細胞由来の介在ニューロン様細胞は移植後9ヶ月まで生存し、注射部位に局在していた。

しかし、野生型マウスで観察されたように、それらは同側および反対側の海馬にも分散していました。プロトコルでは、脳の混乱と圧縮を最小限に抑え、手順の速度と座標の精度のバランスを保つための練習が必要です。このプロトコルは、接続性研究や電気生理学や行動研究などの機能的読み出しなど、研究や関心のある質問に応じて、さまざまな手法と互換性があります。