この方法により、3Dでの肝臓血管・胆道システムのアーキテクチャを解析、可視化、定量化することができます。肝臓病と再生の空間的側面をよりよく理解できるようになりました。この技術の主な利点は、抗体または蛍光イメージングの存在に依存しないことです。
また、どのネットワークが適切にルーメン化されているかを直接視覚化することもできます。この方法は管状システムの分析に適しており、血管、胆管、気道の研究は理想的な領域です。胆管を用い、胆道再生に関する構造変化を理解しました。
マウスの胆道系に樹脂を注入する前に、腸と膵臓をマウスの左側に移動し、PBSで濡れた綿棒を使用して共通の胆管および門脈を露出させる。次に、下の大静脈に小さな横切開を行います。肝臓の腹側を心臓に向かって反転させ、内臓表面とヒラル領域を露出させ、膵臓を横切ってヒラル領域から、オディの括約筋で腸内に流れる共通の胆管を見つける。
ストレート鉗子を使用して、共通の胆管から約5ミリメートルの周囲の組織領域をクリアします。次に、シルクの縫合糸を共通の胆管の下に配置し、共通の胆管の周りに緩いオーバーハンド結び目を結びます。春のはさみを共通の胆管に対して平らに持ち、オディの括約筋の隣に共通の胆管が膵臓と腸に入る場所で、共通の胆管に斜め切開を行います。
次に、黄色樹脂の1ミリリットルをMV硬化剤の50マイクロリットルと混合し、樹脂硬化剤混合物で1ミリリットルのルアーシリンジを充填する。充填したシリンジをチューブセット1と接続し、プランジャーを押して、樹脂硬化剤混合物がチューブの先端から滴り落ちるまでチューブを充填します。鉗子を使用して、共通の胆管切開部の周りの領域をまっすぐにします。
ベバリング先端の最も長いエッジを持つ共通の胆管の開口部にチューブを挿入する前に、胆管の裏側に向かって下向きに。次に、シルク糸の結び目を締めて、共通の胆管内のチューブを固定します。一般的な胆管に樹脂を注入した後、胆嚢と個々の肝臓の葉を観察します。
PBS湿った綿棒で肝臓をマッサージし、樹脂を均等に広げます。樹脂充填胆管末端枝は肝臓表面にかすかに見える。肝臓の表面に樹脂のドットが現れたり、抵抗性が合った場合は、樹脂の注入を停止します。
次に、共通の胆管から引き出してチューブを取り除き、鉗子を使用してシルクノットを素早く締め、樹脂が漏れるのを防ぎます。絹の縫合糸の緩い端を切り取り、門脈注入を妨げないようにします。ポータル静脈に樹脂を注入する前に、まっすぐな鉗子を使用して、肝臓への入り口から約2センチメートルの周囲の組織から門脈を取り除きます。
次に、シルク縫合糸をポータル静脈のクリアされた領域の下に置き、緩いオーバーハンド結び目を結びます。肝臓に遠位する門脈で、結び目を結ぶ前に縦切開を行う。次に、シリンジにグリーン樹脂硬化剤混合物を調製し、先に示したようにチューブを混合して充填します。
鉗子を使用して、周囲の組織を尾側に向かって引っ張ってポータル静脈をまっすぐにしてから、ベベリング先端の最も長いエッジを持つチューブを容器の後側に向けて挿入します。絹糸を締めて、ポータルの静脈のチューブを固定します。ポータル静脈に樹脂を注入した後、血管が樹脂で満杯になっており、PBS湿った綿棒で肝臓をマッサージして樹脂を広げます。
すべての血管が充填されたら、門脈からチューブを引き出し、すぐに樹脂が漏れるのを防ぐために鉗子を使用してシルクの結び目を締めます。マウスから解剖された肝臓のマイクロコンピュータ断層撮影またはマイクロCTスキャンの場合、右内側の肝臓葉を15ミリリットルの円錐状チューブに入れ、チューブを1%アガロースゲルでチューブの総体積の約3分の2に充填し、MicroCT測定中の望ましくないサンプルの動きを最小限に抑えます。CT装置の回転段階にサンプルと15ミリリットルの円錐管を取り付けます。
チューブを測定室に少なくとも1時間熱的に適応させます。サンプルが熱的に適合したら、視野または視野またはFOVの中心に置き、ソースサンプルとサンプル検出器の距離を最適化するか、SSDとSDDを十分なボクセル分解能に達するようにします。パラメータを設定したら、CT測定を開始します。
専用の断層再構成ソフトウェアを使用して、CTデータを再構築します。CT データを分析するには、ファイル、インポート、およびコマンドを選択してファイルをロードします。上部パネルの表面決定機能を使用して、グローバルしきい値を使用してデータ内の樹脂をセグメント化します。
ダイアログウィンドウで、樹脂充填容器のみをセグメント化するように赤い等値線の位置を設定して、ヒストグラム評価で閾値を決定します。左側のパネルで、ボリュームまたは CAD またはメッシュから ROI を作成するモジュールを選択して、樹脂充填容器の対象領域または ROI を作成します。ダイアログウィンドウで、ソリッドからROIを作成するオプションを使用して、処理されたボリュームの名前を選択して確認します。
この ROI のバックグラウンド領域におけるノイズ クラスタの誤ったセグメンテーションを排除します。右パネルの ROI をマークするには、モジュール分割 ROI を右クリックして選択します。ダイアログ ウィンドウで、すべてのノイズ パーティクルを除外する最小ボリューム ボクセル パラメータを設定します。
パラメータ値は実験とデータ依存であり、分析する各サンプルに最適化されます。左側のパネルでは、樹脂コストROIに気泡や樹脂漏出の存在のようなアーティファクトのない滑らかで連続的で固体の運河マスクを作成するために、スムージングモジュールを使用します。CTデータで高い強度値を持つ一般的な胆管注入に使用される黄色の樹脂のようなより吸収性の高い樹脂で満たされたシステムのために、前述のように別のROIを作成します。
新しい ROI を減算する前に右クリックし、樹脂マスク ROI から新しい ROI を差し引いて残りの管状システムの新しい ROI を作成することで、新しい ROI をマスクします。異なるソフトウェアで後続処理を行うため、オペレータ参照に基づいて、両管状システムの ROI をさまざまな形式でエクスポートします。さらに、結果の ROI をボリューム・グラフィックス・ソフトウェアで処理して、最終的な視覚化をイメージまたはビデオの形式でエクスポートします。
本研究では、十分に満たされた肝内胆管および門脈脈管で二重樹脂注入が成功した。代表的な分析は、P15マウスに対して十分に注入された肝臓からのセグメント化されたデータと、側枝に樹脂が見える成体マウスの結果を示す。注射に失敗した典型的な例では、外科的処置中の肝臓への物理的損傷は、樹脂漏出をもたらした。
また、注射前に針やチューブの先端に樹脂を早期に硬化させ、かつ十分な心筋灌流が不十分な場合にシステムの過部充填を引き起こした。マイナー樹脂漏れは、MicroCTデータのセグメンテーション中に手動で修正することができます。高い射出圧力は、血管やダクトを破裂させ、血管またはダクトアーキテクチャを不可逆的に損傷する可能性があります。
さらに、気泡は、管状ネットワークのまばらな充填につながった別の非常に一般的な注入アーティファクトでした。開けたばかりの樹脂を使用した場合、黄色の樹脂注入胆管と緑色の樹脂注入門脈とのコントラストの明らかな違いが認められた。3ヶ月間の貯蔵後、対照は胆道と門脈を区別するのに十分であった。
しかし、沈殿は、充填された門脈の不均一な不透明度として見える2つの樹脂を混合する影響を受けた。樹脂が6ヶ月以上古いとき、コントラストは、黄色注入された胆管を緑色注入された門脈と区別することは不可能な時点まで劣化した。共通の胆管に斜め切開を行うことは重要です。
それ以外の場合は、チューブを挿入することは非常に困難になります。ダクト技術は、ヒラーおよび末梢ローブ領域の明確な特徴を有する臨床的に関連するモデルにおける胆道再生の新しい建築メカニズムを明らかにする。
