研究は、アーヴィングと科学のワイツマン研究所のナノとバイオナノイメージングのためのChernaモスコウィッツセンターで実施されました。 我々は、このプロトコルの設計と実行の援助の彼女Orna Yegerに感謝しています。

1。サンプルの準備<ol><li>検討する組織を抽出した後、石灰化組織は、楽器に配置して撮像することができます。画像にマウスの大腿骨1つは、次の手順に従ってください。 <ol><li> C57/BL6胚18.5日postceutus（E18.5）から死後の足を投稿取り外します。 </li><li>エポキシ樹脂または他の接着剤を使用して、ポリスチレンのピペットチップ（20〜200μl）の狭い方の端をシールし、作業バッファ（PBSまたは他の）で先端を埋める。 </li><li>しっかりと先端に足にフィットし、パラフィルムのシートを持つもう一方の端をシール。 </li><li>適当なホルダーにピペットチップを置き、第3章からプロトコルに従ってください。マウスの足の胚から大腿骨を可視化するため、楽器は40 KV、200μAを設定されています。 8μ解決のために4倍1000投影画像は、取得する必要があります。 </li></ol></li><li>非石灰化組織は、8,9、多くの利用可能なプロトコルのいずれかを使用して目的の組織のX線の減衰量を増加させるために、最初に固定して染色する必要があります。ラットの肺と同じようなサンプルについては、準備のプロトコルは、次のとおりです。 <ol><li>ヌードラットの肺の非小細胞肺癌（NSCLC）NCI - H460のOrthotopical注入</li><li>肺癌の結節は、移植から4週間に検出され始める</li><li>ラットを犠牲にし、直ちにヘパリンと混合生理食塩水でそれを吹き込む</li><li>気管支循環を染色するために左心室にMicrofil（Flowtech）の希釈溶液、（化合物の溶液2 ml、希釈剤と硬化剤0.3mlを3mlの）のにそれを注入する</li><li>ラットの肺と心臓を抽出</li><li> 50 mlのプラスチック製の試験管にしっかりとフィットして、サンプルを（プロトコルの第2章を参照）固定化</li><li>チューブの底にエタノールで減衰布を配置することにより、飽和エタノールの大気を作成する</li><li>楽器のホルダーに接着剤やスクリュー管</li><li>イメージングパラメータを（3章）の設定に進みます。ラットの肺の完全なイメージングのためのソースは、40KV、100μAに設定されています。 16μ解像度を達成するために、ひとつは0.5倍の倍率で2500投影画像を取得する必要があります。 </li></ol></li></ol> 2。サンプルの固定化高分解能で、測定時の試料位置の変化を避けることが大切です。このため、サンプルはしっかりとそのサイズに合うプラスチックの受信者に固定されています。ポリスチレンのピペットチップ、プラスチック製パスツールピペットまたは特別に作られたプラスチック製のホルダーはこの点で使用されています。実験的な要件によると、試料は空気中で調べることができますまたはエタノールまたは緩衝溶液に浸漬。典型的な固定化と楽器のマウス胚の脚部の最終的な位置決めは、図1に示されています。 <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。マイクロCT測定器で、マウス胎児の足の最終的な位置決め。 3。取得パラメータを設定する：X線の電圧と電流、CCDの露光時間<ol><li>ホルダーに入れ、試料は測定器の回転ステージに置かれている</li><li>最初のX線画像は、電圧と電流を任意に設定して取得されます。 </li><li>画像が暗すぎる場合は、1つは、最初の光子の数を増やす必要がありますので、電流が少し増加する。これが十分でない場合、一つはX線管の電圧、すなわち、わずかにX線光子のエネルギーを増やす必要があります。 </li><li>画像が明るすぎる場合は、まず、電圧、電流を小さくする必要があります。 </li><li>画像の明るさは、ビニング増加させることができる。 2のビニングでは2x2のピクセルの各行列の和をとるのに対し、1のビニングでは、考慮に画像の各ピクセルの輝度を取ります。画像はビニング1の場合と比べて約4倍明るくなりますが、半分の解像度を持つことになります。 </li><li>最適な明るさを設定した後、その人が側に最高のコントラストと別の側の実験の合理的な期間の間に妥協するカメラの露光時間を最適化する必要があります。 </li><li>特に低吸収サンプルの画像、、のコントラストは、主に低エネルギーの光子のこと、光子束を低減するフィルタを、使用することによって改善することができます。 </li></ol> 4。サンプルの位置決め<ol><li>作業倍率を選択します。可能な選択肢は、0.5倍4倍、10倍、20倍と40倍です。ビューのフィールドには、増加倍率で減少する。 </li><li> X線源と試料の間に、サンプルと検出器間の距離を設定して、ビューの最適な解像度とフィールドを取得します。サンプル距離にソースを大きくすると、ビューのフィールドを減少させ、分解能を向上させます。検出器の距離にサンプルが逆の効果が得られます。 </li></ol> 3Dで見ることが全体のフィールドは、に存在する必要があります全画角で投影像。一つは、異なる角度で試料を回転させることによって、回転軸にできるだけ近いサンプルを持って来ることによって、これを確認する必要があります。このため、一つには、次の手順に従う必要があります。 <ol start="3"><li> 0度で画像を撮影し、-20℃でサンプルを回転させる。目的のボリュームが横方向にずれている場合、片方が回転軸を再配置することによって、位置を修正する必要があります。 </li><li>補正後は、サンプルは別の角度で回転させることで、興味のある分野は、-90から90度までのすべての角度で画像の内側になるまでの位置は、再び修正。 </li></ol> 5。高分解能の断層像<ol><li>測定中、試料は一度に小さな角度によって、それぞれの角度one投影画像で回転が行われます。画像の総数は常に片側に目的の解像度と別の側面で測定し、ファイルのサイズの時間との兼ね合いで決まります。図2に示すように、一つ一つの突起は別の上の1つを重ね合わせ、サンプル中のすべてのスライスが含まれ、したがって、試料の3次元構造を明らかにすることはできません。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。 0 °（）、45 °（B）と90 °（C）の回転角度でのラットの肺の投影画像。 <ol start="2"><li>唯一の少なくとも-90から90度の間で投影画像を撮影した後、一つは、サンプルボリュームの再構築に進むことができます。再建には、使用するソフトウェアのおよび予測の数の応じて、10分、2時間かかります。再び、3D画像の最終的な品質は、目的の解像度と一費やすしたい時間と結果のファイルのサイズとの兼ね合いで決まります。 </li></ol> 6。画像スケールのキャリブレーション再構成画像のピクセルのレベル（値）は、その画像に対して一意です。つの異なる画像を比較するために、独自の輝度スケールは、各画像に課されなければならない。このため<ol><li>サンプルと同じ実験条件を使用して、標準ファントムによる断層撮影を実行します。 </li><li>ファントムについて得られた値を使用してサンプル画像をキャリブレーション。最も一般的なスケールはハンスフィールド（またはCT）のスケールです。 4倍の場合は15,000（水またはPBS用）のバックグラウンドの値を0に置き換えられ、骨のための35,000の最大値が3000の標準のハンスフィールド値で置き換えられました。他のピクセル値は、それらの制限に基づいて線形補間または外挿に起因する。 </li></ol> 7。画像処理と解析高解像度の画像を取得した後、一つは画像解析ソフトウェアを使用して関連情報を抽出する必要があります。使用するソフトウェアパッケージは、非常に大きなファイル（最大20Gbのまで）で動作するように設計する必要があります。 8。代表的な結果胎生18.5（E18.5）のC57/BL6マウスからの大腿骨の表現 - 四日間鉱化プロセスの開始後は、図3に示します。鉱物層は軟組織がこの準備に表示されなくなってから、（白）はっきりと見える。我々は4倍の線形倍率で1000投影画像を取った。最終的な分解能は8ミクロンです。図1に示すようにボリュームレンダリングの慎重な分析は、骨の体積分率（石灰化組織によって占有されている骨の体積の割合）が0.18であることを示しており、骨密度は、723ミリグラム/ cm 3である。これらの値は、私たちは開発の他の段階にある骨で、この構造体を比較することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。マウスの大腿骨の胚の3D画像の別の表現。横（断面）は（A）、矢状（メディオ横ずれ）セクション（B）とボリュームレンダリング（C）のスナップショットが表示されます。 図4は、非小細胞肺癌（NSCLC）NCI - H460との同所移植した12週齢の雌のヌードラット（RNU）、、の肺の3次元画像を示しています。 2500投影画像は、16ミクロンの最終的な分解能を確保する、0.5倍の線形倍率で撮影された。画像は、（ダウン20ミクロンの直径の）Microfilステンド血管を示しています。画像解析の4週間注入した後、複数の癌結節が形成されていることを示しています。彼らは、肺気量（17％）のかなりの部分を覆っている。肺染色のほとんどは、腫瘍の周辺部で発見された。著しく、図4Bに示すように、いくつかの血管がそのボリュームの約3％の予備的分析によれば、カバー、結節の内部にも存在しています。 <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig4.jpg" alt="図4"/> 図4ラットに成長する癌結節の三次元画像肺。ボリュームレンダリング（）と体積の断面（B）のスナップショットが表示されます。癌の結​​節は、矢印でマークされます。 映画は1。図1のマウスの大腿骨のボリュームレンダリングが。 <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie1.mpg">映画を鑑賞するためにはここをクリックしてください。</a> 図2のラット肺の2。ボリュームレンダリングムービーが 。 <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie2.mpg">映画を鑑賞するためにはここをクリックしてください。</a> 映画（3）肺を介してシリアルセクション。結節は、スライスの大部分のグレーの領域として表示されます。 <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie3.mpeg">映画を見て、ここをクリックしてください。</a>

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利害の衝突は宣言されません。

胎生18.5（E18.5）のC57/BL6マウスは、4日間の鉱化のプロセスの開始後です。開発のこの段階で、将来の骨は、明らかに図3に見られるように、石灰化osteoidsの多くのレイヤーで構成されています。この時点で、一つは鉱化組織が少なくサンプルの処理を必要とするさまざまな楽器と低い解像度で可視化できることを強調してください。より高い分解能を提供するだけでなく現在のプロトコルは（とそれに使用されるマイクロCT機器）、測定のための最善の幾何学的パラメータを選択するため、最高の柔軟性を提供しています。 図4の結果は、同所性肺癌の動物モデルにおいて、ヒト非小細胞肺がんは、血管と血管新生の募集を誘導できることを示している。我々は、肺組織はどちらも移動されなかったことを考慮し、またその形状は、測定中に変更されています。ユーザーは、断層撮影中にこのような変更を避けるために、特別な予防策を講じる必要があります。一部のサンプルについては、特に柔らかい組織のために、一つは、測定中に完全に試料を固定する特殊な保持装置を構築する必要があります。残念なことに腫瘍の周囲に造影剤の高い漏れの存在は、末梢血管の信頼性の定量化を防いだ。その結果、画像ははっきりとムービー2と3に存在する、特に端でいくつかの染色剤によって汚染されます。我々は、この流出を防ぐことができなかったが、その大きさ、形状及び内部の血管の存在を含む癌の結節、に関する有用な情報には影響しませんでした。私たちは、明らかに腫瘍の内部にもいくつかの血流が存在して、少なくともここで検討した気管支循環のために、末梢血液の供給が腫瘍血流に関与すると結論付けている可能性があります。

画像取得のために我々はマイクロXCT - 400 Xradia、コンコード、米国で生産さmicrofocussed X線断層撮影システムを使用している。 画像が処理すると、ImageJ（NIH、米国）、Avizo（VSG、フランス）とMicroView（ゼネラルエレクトリック、米国）のソフトウェアパッケージを用いて分析した。使用可能な任意の画像解析ソフトを代わりに使用することができます

high resolution 3d imaging of ex-vivo biological samples by micro ct

非破壊ボリュームの可視化は、最も効率的ではX線マイクロコンピュータ断層撮影（μCT）となっている断層の技術によって達成することができます。 高解像度μCTは、ex - vivoで生体試料1、2の3次元検査のための非常に多目的な、まだ正確な（分解能1〜2ミクロン）技術です。電子線トモグラフィーとは対照的に、μCTは4cm厚さのサンプルまでの検査が可能になります。組織の週に比べてこの手法は、測定のわずか数時間を必要とします。さらに、μCTは、2D stereologicモデルに依存しないので、それは補完可能性があり、いくつかのケースでも、両方の時間がかかり、破壊的な組織学的方法3、4を 、置き換えることができます。 μCTでサンプル調整と位置決めが簡単ですし、逆に構造に影響を及ぼす可能性のある高真空や低温を必要としません。サンプルが配置され、シンチレータと正確なCCDカメラを含むmicrofocused X線源と検出器の間に180 °または360 °回転させ、それぞれの角度は2次元画像が取得されますし、ボリューム全体が1つを使用して再構築さ​​れています別の使用可能なアルゴリズム5-7。 3D分解能は回転ステップの減少と共に増加する。現在のビデオプロトコルは、高解像度でのイメージングに続いて、サンプルの準備、固定化とポジショニングの主要なステップを示します。

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High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

非破壊ボリュームの可視化は、最も効率的ではX線マイクロコンピュータ断層撮影（CT）となっている断層の技術によって達成することができます。

の高分解能3次元イメージング生体外</emマイクロCTによる>生物試料

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

18.6K ビュー.  Weizmann Institute of Science. 非破壊ボリュームの可視化は、最も効率的ではX線マイクロコンピュータ断層撮影（CT）となっている断層の技術によって達成することができます。

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High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

高分解能光ファイバMicroendoscopy用その場で細胞イメージング

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

生物工学

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

三次元光学分解能光音響顕微鏡

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

のための周期的圧力のバイオリアクターの設計生体外で</em大動脈心臓弁の>研究

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

マイクロ血流の速度プロファイル測定用マイクロ粒子画像流速

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析法による生体組織のイメージング

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

マイカの製造は、高分解能光学顕微鏡イメージングのための脂質二重層をサポート

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

適切なポジショニングと骨のマイクロ アーキテクチャを使用して体内のマイクロ-コンピューター断層撮影の焦点の高分解能イメージングのためのラットの後肢の拘束

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

ひと膵臓の神経島国的なネットワークの高解像度の 3 D イメージング

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the effect of applied extracellular tensile strain on cell populations in vitro via biochemical assays, a device has previously been designed which can be fabricated simply and is small enough to fit inside tissue culture incubators, as well as on top of microscope stages. However, the previous design of the polydimethylsiloxane substratum did not allow high-resolution subcellular imaging via oil-immersion objectives. This work describes a redesigned geometry of the polydimethylsiloxane substratum and a customized imaging setup that together can facilitate high-resolution subcellular imaging of live cells while under applied strain. This substratum can be used with the same, earlier designed device and, hence, has the same advantages as listed above, in addition to allowing high-resolution optical imaging. The design of the polydimethylsiloxane substratum can be improved by incorporating a grid which will facilitate tracking the same cell before and after the application of strain. Representative results demonstrate high-resolution time-lapse imaging of fluorescently labeled nuclei within strained cells captured using the method described here. These nuclear dynamics data give insights into the mechanism by which applied tensile strain promotes differentiation of oligodendrocyte progenitor cells.&#160;

Using a previously designed device to apply mechanical strain to adherent cells, this paper describes a redesigned substratum geometry and a customized apparatus for high-resolution single-cell imaging of strained cells with a 100x oil immersion objective.

一軸引張ひずみ下での生細胞における核動態の高分解能イメージング

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

の高分解能3次元イメージング生体外生物試料