このプロトコルは、学生が個々の感染を明確に識別し、アッセイを簡単に実行するのに役立ち、ウイルス力価の定量をより効率的にします。このプロトコルには、信頼性と再現性のある結果を生み出す簡単な固定および染色手順が組み込まれています。この方法は、疾患に対する抗ウイルス治療の正確性および有効性についての洞察を提供することができる。
このプラキューイングプロトコルのより困難なハードルは、プレートを播種するための細胞数であり、細胞がプロセス全体を通して過密、乾燥、または傷がつかないようにすることです。また、このプロトコルの全体的な細心の注意を払った性質に困難を感じるかもしれません。しかし、実践はこの実験の成功に大きく貢献しています。
開始するには、1 回のラボ セッションで細胞にウイルスを添加してサンプル希釈を完了します。プラークされている各ウイルスサンプルをPBSで段階的に希釈する。通常、最も正確な追跡のために10倍希釈を使用します。
これらの希釈されたウイルスサンプルを細胞に追加する準備ができるまで、すべてのウイルス希釈液を氷上に保管してください。ピペットを用いて細胞培養培地を1つまたは2つのウェルから取り除く。希釈したウイルスサンプルを、各ウェルの側面から滴下して細胞の各単層に慎重に滴下する。
プレート全体がプラークされているウイルスサンプルで満たされるまで、1つまたは2つのウェルごとにこのプロセスを繰り返します。プレート全体を手で優しく揺らします。その後、プレートを摂氏37度で1時間インキュベートして、ウイルス吸着を可能にします。
10分ごとにプレートをインキュベーターから取り出し、もう一度静かに揺らして各ウェルにウイルスをより均等に広げてから、インキュベーターに戻します。吸収されていない接種物を誤って計数する可能性を減らすには、1000マイクロリットルのピペットチップを使用してウェルからウイルスサンプルを取り出し、サンプルを廃ビーカーに廃棄します。2.5ミリリットルのメチルセルロースオーバーレイをプレート上に置き、インキュベーターに戻します。
バイオセーフティキャビネットから取り出す前に、通常、漂白剤、ヨードフォア、または同様のウイルス化物を添加して、廃ビーカーを消毒します。2日間のインキュベーションの後、ピペットを使用して一度に1つまたは2つのウェルからメチルセルロースオーバーレイを取り出し、廃ビーカーに入れます。各ウェルに約2ミリリットルの1%クリスタルバイオレットを50%エタノール中に加える。
染色剤で満たされたすべてのウェルでプレートを摂氏37度で30分間インキュベートする。この時点で、前述のように廃ビーカーを消毒します。流出がはっきりするまで水道水でプレートを激しく洗ってください。
各希釈系列のプラーク数に約 10 倍の差があることを確認します。この図は、プラーク数の10倍の減少を示しており、プラークの可算数は、3つの反復すべてについて10からマイナス4の範囲に減少した。図中の最初の3つの画像は、10〜マイナス3の希釈率のプラークを描いている。
ただし、下段はプラークアッセイがうまく行われなかった場合の結果を示しています。Vero細胞が基質から完全に持ち上げられた上部の周りの目に見える領域の希釈から見えるプラークはほとんどありません。同様に、この図は、プラークアッセイ中の細胞の乾燥または誤った取り扱いの問題を示しています。
しかし、この図は、ベロ細胞播種が貧弱であることを批判的に示している。すべてのウェルはより濃い紫色の斑点を示し、細胞がウェル全体にうまく広がらず、クラスター内で互いに積み重ねられていないことを示しています。最良の結果を得るには、ウイルスがプレート全体に均一に広がっていることを確認し、プラークが凝集しないようにします プラークアッセイは、生ウイルスのみをカウントするため、他の定量方法よりも効果的です。
そうすれば、真の抗ウイルス効果を確立することができます。さらに、この技術により、フォマイト上のウイルスの存在を定量化し、ヘルペスウイルス研究の分野における新しい医療機器からの薬物送達の有効性を探ることができました。
