この方法は、光イメージングが利用できないシステムにおける核および細胞質転座に関するタンパク質密売分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、光イメージングを伴わずに一時的なタンパク質の動きの研究のための一般的なプロトコルとして適用することができるということです。ウイルス感染の20〜24時間前に、ウイルス感染種子50〜4回ヒト胚性肺またはHEL線維芽細胞は、4つのウェル11ミリメートルのよろめきスライドおよび成長培地上に、5%の二酸化炭素を有する摂氏37度で一晩培養する。
培養液をこぼれさせないために、細胞の均等な分布を確保するためにスライドを十分に揺らすことが重要です。翌日、上清を置き換えて、70〜80%のコンフルエント培養物をセルあたり410個のプラーク形成ユニットを含むミディアム199に置き換え、スライドを揺れで摂氏37度に1時間置きます。インキュベーションの終了時に、上清を新しい増殖培地に置き換え、適切な実験感染期間のために細胞をインキュベーターに戻します。
ウイルス感染細胞の免疫蛍光染色のために、PBSで細胞を3回速く洗浄する。続いて、PBSあたり4%のパラホルムアルデヒドの200マイクロリットルで8〜10分のインキュベーションが続いた。固定の終わりに、1回の洗浄につき200マイクロリットルのPBSで細胞を3回洗浄し、1ウェルあたり0.2%の非イオン界面活性剤を100マイクロリットルで細胞に5〜10分間透過させる。
示されているようにPBSでパーメアビライズされた細胞を3回洗浄し、各ウェルに200マイクロリットルのブロッキングバッファーを加え、室温で1時間のインキュベーションを行います。次に、2時間の室温インキュベーションのために、目的とする一次抗体の適切な濃度を各ウェルに加える。インキュベーションの最後に、新鮮なブロッキングバッファーに3、10分間の洗い込みで結合していない一次抗体を取り除き、光から保護された室温で1時間のインキュベーションのために各ウェルに適切な二次抗体を加えます。
インキュベーションの終わりに、デモンストレーションされたブロッキングバッファーで細胞を3回洗浄し、続いてPBSで1回洗浄し、各ウェルにDAPIを添加したアンチフェード実装培地を1滴加えます。その後、スライドの上にカバースリップを置き、透明なマニキュアでカバースロープを密封します。カバースリップを取り付けながら穏やかな圧力をかけると、余分な取り付け媒体が取り除かれ、高品質の画像の取得を確実にするのに役立ちます。
標識された感染細胞の共焦点イメージングでは、適切な二次抗体およびDAPI波長を選択し、画像フォーマットを平均線8で1,024 x 1,024ピクセルに設定します。その後、100xの目的の下で4ウェルスライド上の各井戸を画像化します。多数のセルをカウントする場合は、40xの目的の下で同じウェルの連続したフィールドから5〜10個の画像を取得します。
ICP0の核分布と細胞質分布を解析するには、共焦点アプリケーションソフトウェアでプロジェクトを開き、画像を選択します。[数量] タブを開き、[ツール] メニューの [対象地域の並べ替え] を選択します。[線を引く]を選択し、解析対象のセルを横切る縦線を描画します。
ヒストグラムは、対象タンパク質とDAPIの両方の線に沿って蛍光強度を示して表示されます。背景染色に基づいて、各実験におけるタンパク質の細胞下分布の分析に関心のあるタンパク質の強度に対して一定の閾値を設定する。タンパク質シグナルが、平均して核領域の閾値を下回っている場合、DAPI境界を超えて閾値を超えているが、タンパク質シグナルを主に細胞質内に位置付けて分類する。
タンパク質シグナルが核全体の閾値を超え、DAPIシグナルの境界を越える場合は、タンパク質シグナルを核プラス細胞質局在化としてグループ化する。タンパク質シグナルが核内の閾値を上回る場合、平均してDAPIシグナル群の境界外の閾値を下回るが、核局在としてタンパク質シグナルをグループ化する。最後に、各サンプルから200個以上の感染細胞を異なる感染時点で集計し、そのデータを棒グラフにプロットして、時間の経過に応じる目的のタンパク質の動きを示す。
実証したように、この方法は、対象となるタンパク質の核細胞質転位の分析を容易にする。例えば、ウイルス感染が進行するにつれて、感染した細胞タンパク質ゼロ、またはICP0細胞内分布変化が進行する。感染時のICP0人身売買に必要な要素を理解するために、ICP0の動きは、異なる感染段階で野生型および変異型ヘルペスウイルス1感染細胞で追跡することができ、感染の異なる時点でのICP0の細胞下分布の評価を可能にする。
ウイルスが細胞に等しくアクセスできるように単層培養を使用し、ウイルスのタイトルに従って感染の多重度を正規化して、ウイルス間およびウイルス内で感染の進行が同等になるようにすることを覚えておくことが重要です。この技術は、それぞれの開発の後、生物学および細胞ウイルス学の研究者が、細胞集団内の目的とするタンパク質の時間的な細胞内局在を研究することによってタンパク質の動きを探求する道を開いた。
