キュベット型高速繰り返し速度蛍光光度計による コラシウム 属の付着ステージの光生理機能の測定

このプロトコルは、自然界と同様に、付着した藻類がまだプランクトンに付着している間に、付着した藻類の光合成活性を測定する。この技術の主な利点は、サンプルの気を散らすことなく、光生理学の測定をリアルタイムで行うことができることです。ベースライン蛍光に対する動物プランクトン個体の影響を調べるために、付着した生物を含まない培養物から成体のスカポレベリス・ムクロナータを調製する。

次に、腸内含量からの蛍光を避けるために、FLW中の個体を摂氏20度で少なくとも90分間飢えさせる。1.5ミリリットルのFWLをキュベットに注ぐ。希望の数の s を拾います。

ムクロナータ個体は、光学顕微鏡下でピペットを用いて倍率100倍で、キュベット内に移した。FLWを追加してサンプル量を最大2ミリリットルにし、高速繰り返し率蛍光光度計測定の前に15分間、摂氏20度の低照度下で順応できるようにします。次に、「実行する行為」をクリックして測定を開始し、サンプルごとに測定を3回以上繰り返します。

結果のプロットからF0値を読み取ります。光学顕微鏡下でピペットを用いて脱皮甲羅でコラシウム種を100倍の倍率で拾い上げ、FLWで洗浄する。クリーンベンチ上の10ミリリットルのガラス管にAF-6培地中のコラシウム種を無菌的に接種する。

増殖チャンバー内で培養物をNC2温度に維持し、細胞沈降を防ぐために少なくとも1日1回は手でガラス管を優しく振る。コラシウム種からの蛍光であるクロロフィルに対する動物プランクトン個体の影響を調べるには、生物を付着させない成虫のs. mucronataを使用する。

腸内容物からの蛍光を避けるために、FLW中の個体を少なくとも90分間飢えさせる。キュベット式高速繰り返し速度蛍光光度計を設置。次に、前培養コラシウム種の1.5ミリリットルのサブサンプルをキュベットに注ぎます。

次いで、所望の数のs. mucronata個体をこれらのキュベットに移し、濾過された媒体でサンプル量を最大2ミリリットルにする。20°Cの低照度下で15分間個体を順応させてから、高速繰り返し速度蛍光光度計測定を行います。

「act to run」をクリックして測定を開始し、サンプルごとに測定を3回以上繰り返します。結果のプロットからF0値とFM値を読み取ります。ベースライン蛍光を補正するには、0.2マイクロメートルの注ぎ口サイズのフィルターを使用して培養液をろ過し、蛍光を測定します。

コラシウム種の F0 および FM からベースラインサンプルの F0 を減算するか、[オプション] タブの設定で空白の補正値を変更します。光学顕微鏡下でピペットを使用して、コラシウム種を持つ s. mucronata 個体を分離します。

その後、FLWを用いてムクロナータを洗浄する。を転送します。

ムクロナータを100ミリリットルのFLWに入れ、NC2温度で暗条件下で90分間飢餓状態に保ちます。1.5ミリリットルのFLWをキュベットに注ぐ。約10秒の転送。

コラシウム種を含むムクロナータ個体をキュベットに入れ、FLWを加えてサンプルを最大2ミリリットルにする。N2C温度の低照度下で15分間個体を順応させ、テキスト原稿に記載されているようにクロロフィルの蛍光を測定する。付着細胞数を列挙するには、高速繰り返し速度蛍光光度計測定を行った後、サンプルを2%グルタルアルデヒドで固定する。

その後、光学顕微鏡下でs. mucronataのいくつかの焦点深度と位置で写真を撮ります。sによるベースライン蛍光またはクロロフィルa蛍光に対して有意な影響はなかった。

ムクロナータは1ミリリットルあたり最大5個体。しかし、最大光化学効率および非光化学消光は、s. mucronata密度が1ミリリットルあたり7.5個体であった場合に有意に影響を受けた。

AF-6培地中の固定相に対する付着段階およびプランクトン段階におけるコラシウム種の植物生理機能の季節変動は、同様の平均最大光化学効率および非光化学消光を示した。暗条件下でのコラシウム種の付着段階については、非光化学的消光がカルシウムよりもマンガンの方が高く、21時間で低い光強度であることを除いて、光生理学的パラメータに有意差はなかった。プランクトン期については、PS2吸収断面が3時間でカルシウム処理よりもマンガンで有意に低かった。

効果的な光化学的効率は有意に高かったが、非光化学的急冷は、21時間での対照よりもマンガン処理において低かった。増加した光の下で、マンガンは、21時間で非光化学クエンチにおいて、3時間でPS2吸収断面を減少させる傾向があったが、3時間で有効な光化学効率を増加させる。カルシウムは、増加する光の下で非光化学消光をわずかに改善した。

しかし、3時間で有効な光化学効率が低下した。最も重要なことは、基質生物の効果です。藻類が異なる種または材料に付着した場合、その効果は異なる可能性がある。

このプロトコールに加えて、炭素固定または酸素生成速度の測定は、実験操作に対するカルシウム生産性の応答を明らかにするのに有用である。このプロトコルにより、付着した藻類の光合成活性が環境変化にどのように反応するかを明らかにすることができます。