MAは行財政支援のためのオーストリア科学基金（FWF、J3086-B11）と感謝のシュレーディンガーの交わりマックスプランク協会によってサポートされていました。 GSとJHは、ウィーン科学技術基金（WWTF、LS13-030）によってサポートされていました。

<ol>
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T., Forrer, P., Amstutz, P., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+repeat+proteins:+well-expressed,+soluble+and+stable+proteins+from+combinatorial+libraries+of+consensus+ankyrin+repeat+proteins.">Designing repeat proteins: well-expressed, soluble and stable proteins from combinatorial libraries of consensus ankyrin repeat proteins.</a> J Mol Biol. 332, 489-503 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

in situでのタンパク質-タンパク質相互作用を測定することは、TCRのpMHC-11に結合するような低親和性相互作用を扱う場合は特に、非常に望ましいです。オン速度、ならびにこのような相互作用の安定性を大幅に結合が起こるような状況下で、特定の影響を受けるためです。低侵襲FRETベースのイメージング手法は、原理的にはこのように、このようなタスクに最適です、まだ最初に克服しなければならないハードルの数を含みます。携帯自家蛍光によって発生するノイズは、測定の感度を制限するため、最小限に保たれるべきです。 TIRF顕微鏡は、理想的な選択13-15のタンパク質で飾ら平面ガラスサポート脂質二重層の形で、非常によく12本必要性を提供していますが、ガラススライドの官能化を必要とします。一部reconstitutiveアプローチのもう一つの利点は、組換え二重層常駐FRETパートナーがずっとmとすることができるということです鉱石は容易に細胞表面に発現するタンパク質で可能であるよりも小さく、明るい蛍光体で定量的な部位特異的かつ合理的な方法でラベルされました。以前に2テストされたようなTCRは、組換えのscF V S、T細胞認識に影響を与えないものでタグ付けされています。また、SLBのタンパク質組成物は、例えばpMHCsの密度およびアクセサリー因子の選択は、1つの特定のニーズに調整することができます。我々は以前、刺激pMHCsの様々な密度で実験を行っているが、 オフ 2D-Kおよび2D-K D 2で有意差を検出していません。 これまでのところ、ここでのMHCクラスII分子の認識は、主に両端が開いているので、蛍光体の結合のためのリンカーを含む、より大きなペプチドを収容し、それらのペプチド結合溝、の性質上、のみを扱ってきました。いくつかのケースでは、このようなアプローチは、MHC CLAを標識するために働く可能性がありますSS私は16分子が、大きな注意が実験での使用を確認するために取られるべきです。表面プラズモン共鳴によってインビトロで測定されるT細胞増殖アッセイ、ならびに動力学結合のpMHC-TCRを介して測定することができる抗原に対するT細胞の感受性を、リンカーおよびフルオロフォアの添加によって影響されてはなりませんペプチド。代わりに、私は自分自身を分子MHCクラスは、重鎖（未発表の観察）の配列内の不対システインの導入と部位特異的に標識することができます。 適切な分子プローブを使用して任意のシナプスのタンパク質 - タンパク質相互作用は、原理的には、本明細書中に記載の方法で研究することができます。このようなプローブは、 例えば、のscF V Sまたは設計されたアンキリンリピートタンパク質（ダルピン）17、一価であるべきであり、関心の相互作用に影響を与えることなく、安定的に彼らの標的に結合する必要があります。もちろん、構造informationが合理的なプローブ設計のための非常に望ましいですが、絶対に必要ではありません。 FRETパートナーの新しいペアを確立するときは、最初に一括でFRETを記録し、分析することをお勧めします。標識結合の部位は、FRETシグナルを最大化するために、また、測定されたFRET収率がインター染料距離に基づいて異なることを確認するために、大幅に変化させることができます。システムが最適化されると、単一分子は、信号が10〜30％に多量のFRETパートナーのラベルを制限し、単一分子は照明の分野で解決可能になるまで少量のFRETパートナーを漂白することによって記録することができるFRET。 少なくとも最後にではなく、それはのSLBは、生理的形質膜のすべての側面一部に近似するがないことに留意すべきです。このような膜の曲率と柔軟性、ドメイン区画、細胞骨格の再編成および細胞運動だけでなく、表面発現膜タンパク質の高いさまざまな資質としては、SLBので表されていないが、Tに影響を与える可能性があります彼は調査中で処理します。多くの努力は、TIRFイメージングにアクセスできない生理的シナプスにおける単一分子分解能でのタンパク質 - タンパク質相互作用をモニタリングすることを可能にするの画像診断法を確立するために投資する必要があります。

T細胞が抗原を認識する方法のより基本的な理解は、T細胞とAPCとの間に形成された免疫学的シナプスの中に、すなわち、適切な場所で見ることが必要です。ここでは、分子の結合反応速度のみセルラー力、膜構造と膜タンパク質との間の横方向の相互作用だけでなく、シナプス特有の幾何学的制約を含む細胞パラメーター、に大きく依存するが、関連する相互作用パートナーの固有の生化学的特性によって決定されていません3。生化学的アプローチは、それらが関連するシナプス膜の少なくとも一つの破壊を必要とするような分解能が制限されます。この理由のためにFRETベースのイメージング法は、抗原pMHCs 2 TCRの結合をモニターするために開発されました。ここでは、T細胞は、組換えとサイト特異的に標識されたTCRβ反応性単鎖抗体フラグメント（SCFのV）で装飾され、計画に直面しています<html>蛍光標識された抗原ペプチド、共刺激分子および接着タンパク質を搭載したMHCクラスII分子を保有ARガラスサポート脂質二重層（のSLB）。シナプスは、色素で標識したTCRと全反射蛍光（TIRF）顕微鏡によってバルクおよび単一分子レベルで監視することができFRETの色素標識のpMHC結果、間の結合。 この記事では、T細胞のシナプスをアッセイするためのSLBを利用する機能的T細胞のカルシウムフラックスアッセイを介してそれらの完全性を検証する、バルクでFRETの測定を行い、単一分子の感度で、取得したデータを分析する方法を詳細に説明します。勧告は、二層の官能化のために必要な適切に準拠したタンパク質を生産することに提供されています。適切なTIRF顕微鏡の二層形成とセットアップに関するより具体的な情報については4を背中合わせに発表され、追加のパブリックアクセスJoveの出版物を参照してください。 10トン &quot;&gt;のSLBの自然官能化のSLBは、容易に（短い：POPC、90から99%）2脂質1-パルミトイル-2-オレオイル-SN-gylcero -3-ホスホコリンを含む単層小胞（SUV車）から生成することができ、1,2- dioleoyl- SNを -グリセロ-3 - {[N（5-アミノ-1-カルボキシペンチル）イミノ二酢酸]スクシニル}（ショート：DGS NTA-Ni系、1〜10％）。 SUVが隣接する平面二重層4を形成するために、きれいなガラススライド上に広げました。 DGS-NTA-Niは、合成NTA-Niの含有頭部基（ 図1A）とポリヒスチジン媒介複合体形成を介してポリヒスチジンタグ融合タンパク質を固定するのに役立ちます。安定な会合のために1は、一般的に12個のヒスチジン（ICAM-1-12H、B7-1 -12H）（ 図1B）を含むつのタグでネイティブの膜貫通ドメインおよび接着タンパク質のICAM-1および共刺激分子B7-1の細胞質尾部を置き換えます。ペプチド負荷クラスII分子IE kは2つの膜埋め込 ​​み（α及びβ）のポリペプチド鎖を含みます秒。両鎖の膜貫通/細胞質ドメインは、6つのヒスチジンそれぞれ（α6Hβ6HまたはIE K -2x6H IEのk）を含むタグと交換する必要があります。代替、12個のヒスチジンとα鎖を拡張し、タグなし（12Hの βの0HまたはIEのk個の -12HαIE kに上昇を与える）β鎖の細胞外ドメインを残すように、満足のいく結果（ 図1B）を生じさせます。 pMHCsの部位特異的標識それは意味の平衡結合定数にFRET測定利回りを変換できるようにするために、化学量論的および部位特異的のpMHCにラベルを付けることが重要です。これは、組換えヒスチジンタグ付きMHCクラスII分子2,5のペプチド結合溝にロードされた合成ペプチドの化学的標識化によって達成することができます。ペプチドは、WとしてT細胞エピトープの全ての残基を含みますエルシステインに続く短いC末端リンカー（GGS）として（例えば蛾シトクロムc（MCC）ペプチドANERADLIAYLKQATK- GGSCに、リンカーは太字で示されています）。このシステインは、マレイミド色素誘導体を用いた化学量論的にペプチドを標識するために使用されます。この時点で、特別な注意は、システイン含有ペプチドを定量的色素結合の検証に専念する必要があります。ペプチド - 色素付加物のHPLC精製は、推奨およびエレクトロスプレーイオン化質量分析によって従うべき有します。 （染料なし）ペプチド遊離体に対応する任意の記録質量は不完全なラベリングを反映しています。これが本当であれば、標識が定量的とみなされるまで、HPLC精製ペプチドは、色素標識の連続した​​ラウンドに供されるべきです。この方法は、試料のイオン化のためにレーザー照射することを含むようにMALDI-TOF質量分析を避けるべきであることに留意されたいです。ペプチド質量を読み出すため、underrepreされる前に、この処理は、添付の敏感な蛍光色素分子を分解する<html>色素結合のsents度。 価単鎖F V断片を用いた細胞結合TCRの間接まだサイト特異的標識それはまだ部位特異的に生細胞の表面関連タンパク質をセルに色素を結合するために挑戦しています。表面露出のTCRは、このハードルを克服するために、TCRβ -反応性モノクローナル抗体H57-197 2の遺伝子からの一価の単鎖バージョン（SCF V）が構築されています。 TCRとの複合体中のこの抗体の結晶構造は、合理的に（対応するFRETパートナーの染料が結合している）MHC関連ペプチドのC末端に近接したセリン残基をするために置換されたバージョンを設計することができシステイン残基。この変異体システインはその後、色素コンジュゲート（ 図2）のための受容体として機能します。 FRETを記録するための方法論NT &quot;&gt;バルクFRET値は、選択されたインター色素距離との関係を検証することが最も適しているとこのTCR-のpMHC結合システム 2で測定効率をFRET。また、バルクのFRET測定は、シナプスTCR-のpMHCの親和性（で定性的および定量的な差を明らかに下記参照）とプロトコルセクション3.2。FRET効率を定量化するための様々なアプローチは、文献6で導入されました。この記事では、FRETを介して記録されています （a）は、ドナーアクセプター漂白後の回復、及びビアを （b）は、FRETアクセプター放出を感作。 最初の方法は、（a）は、容易に光退色することができるFRETアクセプター、むしろ光安定であり、ドナーの使用を必要とします。それに加えて、光退色アクセプターはもはやドナー蛍光を消光することが可能であることを保証しないことが重要です。同じ検出チャネル（ドナー）を定量化するために使用されるように、補正は係数ありませんD全く色収差がこの方法論は、シンプルで信頼性の高いレンダリングする、考慮しなければなりません。しかし、定量的な測定は、同一試料の場で繰り返すことはできませんし、FRETの変化が経時的に記録することはできません。 （アクセプター漂白の前に）最初のFRETドナーおよび（FRETアクセプター漂白後の）第二FRETドナー画像取得の間を通過する時間を最小限に分子拡散または高速漂白工程をを目的としなければならない細胞の運動性によって引き起こされる影響を回避します。これは、照明及び漂白時間を最小限にするために、FRETアクセプターの励起波長の強力なレーザ光源を使用することを推奨しています。 これに対し、（b）は、感作されたFRET発光測定のアプローチにFRETドナーが励起され、FRETアクセプターの発光は、FRETアクセプターチャネル中で観察されます。 FRETアクセプターシグナルの変化は、赤方偏移アクセプターチャネル（トンにFRETドナーの時間が、放射にわたって記録することができますermed bleedthrough）と正確に決定し、記録FRETアクセプターチャネルから減算する必要がドナーの励起を経由して、アクセプター相互励起をFRET。このためのFRETドナーに対応するFRETアクセプタ画像が空間的に整列されなければなりません。 単一分子の検出（SM）のイベントをFRET 励起源、感度カメラとノイズ減衰全反射顕微鏡としてレーザーを使用すると、単一のフルオロフォアの蛍光は簡単に時間をかけて追跡することができます。同様に分子間smFRET事象の検出のために真です。しかし、合併症は、FRETドナーbleedthroughとFRETアクセプターの相互励起によって引き起こされる可能性があり、したがって、細心の注意がsmFRET実験における蛍光体濃度を調整する際に注意しなければなりません。 以下に提供されたプロトコル（プロトコル部4）でTCRは少量でFRETアクセプタとして高い豊富とのpMHCにおけるFRETドナーとして選ばれました。 FRを減衰させます十分に、蛍光のSCF Vと非蛍光のSCF VとTCRの90から70パーセントとTCRの10〜30％を飾るbleedthrough ET供与。それは単一分子FRETチャネルと共焦点であるため、ここではFRETアクセプターチャネルは単一分子チャネルとして選択されまし​​た。これはsmFRET検証の基礎であり、FRETアクセプターの単一分子とsmFRETイベントを揃えることができます。 smFRETの測定によってシナプスオフ速度の抽出両方のFRETドナーの光退色とアクセプターをFRETは、単一分子からの相互作用の半減期を抽出する際、考慮される必要はありトレースをFRET。単一のドナー-アクセプター対Nのような外見（0）の開始時に観察可能なFRET-信号の数は、受容体-リガンド複合体のアンバインドと光退色の両方で時間をかけて削減されます。次のように与えられた時間N（T）での複合体の生存数は数学的に表現することができます。 光退色項exp（-t /τ 漂白剤 ）で、時間t はすなわち 、漂白のみ照射中に発生する観測の数 Nとの積（なぜなら、非連続的な、個別の観察モードの病気照明時間tで記述されています）。運動項のEXP-（T /τ オフ ）内の時間tは、観測値の数の積であり、nおよび単一のFRET観察のための時間t 遅れ （ すなわち 、動力学的ア ​​ンバインドが継続的に行われます）。式1は、のように表すことができます。 <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq2.jpg" />用語τ 漂白剤/τ 病気デ漂白は、その指数関数のために発生し、期待値&lt;N 漂白剤 &gt;のように定義されるまで、観測数をcribes。次のように方程式2を簡略化することができます。 <img alt="式3" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq3.jpg" /> 時間 tの後に観察FRET事象のフレーム数N（t）の期待値は、&lt;N（T 遅れ ）&gt;直接実験から決定されます。これは、実験で選択された観察（T 遅れ ）、τ オフ（k offをオフ速度の逆数）のための未知の値の間に設定可能な時間に依存し、漂白が発生する前に、観測数の期待値を&lt;N 漂白します &gt; 。 したがって、Tのうちの少なくとも二つの値のための期待値&lt;N（T 遅れ ）&gt;の計算<sub&gt;ラグは&lt;N 漂白 &gt;とオフ τの実験的な決意を可能にします。 FRETベースの測定によってシナプスの2D-K D値を抽出します TCR占有すなわち A、バウンドのTCRと合計のTCRとの比率を測定し、シナプスの2D-K D値を決定する中心的です。式（4）によると、この用語は、限り、FR​​ETアクセプターとしてのTCRは、FRETドナーおよびpMHCsとして機能するようにして測定FRET収率に正比例します。 <img alt="式（4）" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq4.jpg" /> = TCR占有で、C =変換係数 Cは、FRETシステムに依存し、フルオロフォアを用いた、定数です。以下に示すように、実験的に決定することができます。式5ときによれば、2D-K Dに変換することができます。前の二重層のT細胞を添加するTCRリガンドの初期密度が知られています。これは、SLB接続タンパク質の高移動度であり、またのSLBは、リガンド2のほぼ無尽蔵の貯蔵器を提供するからです。 <img alt="式（5）" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq5.jpg" /> [のpMHCの初期 ]と=のpMHCの初期密度の前のT細胞の添加に式では4と5一つは簡単に、TCRのpMHCとの間のシナプス2D-K D を決定することができます 。これは、最も確実に、アクセプター漂白（プロトコルセクション3.1を参照）の後、ドナーの回復に基づいて、FRET測定で行われます。 しかし、C私はFRET FRET強度との関係を測定し、TCRの占有率Aを決定しなければならない（バックグラウンドについて補正し、FRETドナーおよびアクセプタbleedthroughクロス励起FRET）。このため、あります単一のTCR関連FRETドナーフルオロフォア（例えば、Cy3またはAF555）SMの平均蛍光強度との比Rを知る必要があります私は、ドナーと単一分子の平均強度をFRETのイベントは、私がFRET SM FRET。 Rは、蛍光検出のために使用される質問、発光フィルターとカメラ内FRET系に依存します。 TCRは、直接式（6）に従って決定することができる人数<img alt="式6" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq6.jpg" /> R = SMと私はFRETドナー / SMをFRET RはにつながるH57 scFv-たCy3 / Cy5ののpMHC-システムのための1.45のように決定しました。 私は1.45•/バルクI TCR-のCy3をFRET =バルク TCR占有a及びFRET歩留まりとの関係は、FRETドナーによって決定することができる復旧アクセプター漂白後のY。線形近似の図4A【選択勾配に示すように、この両方のパラメータの数TCRマ ​​イクロクラスターのために互いに対してプロットされているため（式4）からの変換係数Cを示しています 。 1.995までのCy3 / Cy5のFRETのpMHC・システムと、（b）適用顕微鏡システムの構成- 図4（a）に示すように、Cは、（A）H57のSCF Vの金額。 TCRは、以下のように容易に推定することができる人数： TCR占有A = 1.995•得FRET

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >LB-media</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10000713</td>
			<td >bacterial expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf900 II</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >10227402</td>
			<td>insect cell media for baculo virus production</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10564038</td>
			<td>insect cell media for baculo virus expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf9 cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11496-015</td>
			<td>cells for virus production and expansion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Five Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>B855-02</td>
			<td>cells for potein expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB-media</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10000713</td>
			<td>bacterial expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centramate System</td>
			<td>Pall</td>
			<td></td>
			<td>protein concentartion from large volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centramate cassette 10kDa cutoff</td>
			<td>Pall</td>
			<td>OS010T12</td>
			<td>protein concentartion from large volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC800308</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td >5123</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#196;kta pure 25L</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>29-0182-24</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superdex 200 10/300 GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5175-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superdex 75 10/300 GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5174-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mono Q 5/50GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5166-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ni Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5318-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricorn 10/20 column</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >28-4064-13</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson HPLC system</td>
			<td >Gilson</td>
			<td ></td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*250mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000250X212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*50 mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000050G212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricorn 10/20 column&#160;</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >28-4064-13</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson HPLC system</td>
			<td >Gilson</td>
			<td ></td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*250mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000250X212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*50 mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000050G212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 maleimide</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy5 maleimide</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>PA25031</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td>A-20346</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A-20347</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fura-2, AM, cell permeant</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >F-1221</td>
			<td>calcium-sensitive dye for cell labeling</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dimethyl sulfoxide</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >151874</td>
			<td>for dissolving fura-2 am</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hank&#39;s Balanced Salt Solution plus calcium/magnesium</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10225362</td>
			<td>imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin lyophilized powder</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >A2153</td>
			<td>supplement for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >14-4-4S antibody</td>
			<td >affimetrix eBioscience</td>
			<td >14-5980-81</td>
			<td>blocking antibody for H2-I-Ek (recognized by the 5c.c7, 2B4 and AND TCR)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml polypropylene round-bottom tube</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >FALCON 352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.22 &#956;m Ultrafree-MC centrifugal filter unit</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >UFC30GV0S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >GVWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TetraSpeck Microspheres, 0.1 &#181;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td>
			<td >Life technologies</td>
			<td >T-7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope for fura-2-based calcium measurements&#160;</td>
			<td >LEICA</td>
			<td >DMI4000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope for (single molecule) FRET measurements</td>
			<td >LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS</td>
			<td >for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >planar supported lipid bilayers</td>
			<td ></td>
			<td >for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640, with L-Glutamine</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >11554416</td>
			<td>T-cell media</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >non-essential amino acid 100X</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >SH30238.01</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >penicillin/streptomycin/L-glutamine 100x</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >12000226</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-mercaptoethanol</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >M6250</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mouse interleukin-2 recombinant protein</td>
			<td >BPS Bioscience</td>
			<td >90185-B</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Research Grade Fetal Bovine Serum</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >SV30160.03</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Origin (analysis program)</td>
			<td >OrigenLab</td>
			<td >http://www.originlab.com/</td>
			<td>non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag])</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring tcr-pmhc binding in situ using a fret-based microscopy assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

FURA-2カルシウムを介した細胞内カルシウムの記録染料、ならびに刺激効力を確認するために、その後の細胞解析、ひいてはのSLBの機能は、 図4に示されている。明らかになるように、カルシウム濃度は、T細胞の上昇（として発現ベースラインはすぐに、すぐに彼らは刺激するSLBに落ち着くように）1である正規化FURA-2 340nm / 380nmの比。カルシウムレベルがまもなくTCR結合とするT細胞活性化を終了からブロックpMHCs抗体を添加した後にベースラインレベルに戻ります。 図6は、（図4に示されている）FRET収率を測定するために使用され、2D-K D値を計算するのに役立つ受容漂白、後のFRETドナー回復を伴う典型的な実験を示しています。 FRET Aの迅速かつ完全な切除後、AF555を介しラベルTCRを表すFRETドナー強度の増加を、注意してくださいcceptor種（ここではpMHCsに関連したAF647）。また、明らかにFRETチャンネルに強い減少、 すなわち 、FRETドナー励起下でのFRETアクセプターチャネルは、FRETアクセプター漂白した後、あります。ほとんど見えない残りの信号は、ドナーbleedthroughをFRETに相当します。個々のTCRマ ​​イクロクラスターまたは全体のシナプス内の収率は示さ測定された強度値（ 図6B）に基づいて計算されるFRET。 図7には、2つの時間枠に表示単一分子FRETイベントの軌跡と時間経過を示しています。導入に上記で概説したように、このような挙動は、両方の結合シナプスTCR-のpMHCの崩壊と光退色が原因で発生します。これらの2つの寄与とを区別するために、実験的な取得時間フレームは、期間中に変化させることがあります：光退色は一定のまま、FRETイベント軌道長さの変化が唯一の結合速度によって引き起こされます。 W tracelengthsの定量、<html> HICH は 、図7に示されるオフ速度及び漂白の計算のための基礎を形成する、3の表1に提供されています。 2D-K D Sの決意は、FRETドナーラベルのTCRのためのバルクのFRET利回りの記録が必要です。実験的に推定された定数 C（ 図4）を使用すると、TCRのマイクロクラスターまたは全体のシナプスについて測定FRETの収量は、TCRに占有変換することができ、 すなわち 、のpMHC-従事し、総TCRの割合（ 図4C） 。前のT細胞の添加にSLBに存在する既知のpMHC密度で、値は、シナプスの2D-K D値（ 図4D）を決定するために適用することができます。オン率は質量作用の法則を用いて計算することができる（ 上の 2D-K = 2D-K / 2D-K D をオフ ）を決定し、シナプスからオフ速度および2D-KD値。 1 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 53157 / 53157fig1.jpg &quot;/&gt; 図1.平面ガラスサポート脂質二重層（SLB）システムの概要図。 （A）のSLBは、対応する脂質からなるPOPC（90から99までパーセント）と合成脂質DGSのNi-NTA（1-10％）で構成され、きれいなガラス表面は単層小胞（SUV車）で充電しているときに自発的に形成されています。 （B）は、一旦形成されると、そのようなのSLBは、T細胞のためのAPCとして機能するように、B7-1タンパク質およびICAM-1接着タンパク質共刺激、pMHCs由来の可溶性ポリヒスチジンタグ化細胞外部分で官能化することができます。 SLBの準備の詳細についてはAxmann ら 4を参照してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig2.jpg" /> Figu<html> その場で結合TCR-のpMHCを定量する2.再フェルスター共鳴エネルギー移動に基づくアッセイ。 （A）H57単鎖フラグメントと複合体TCRの複合構造のpMHC係合は、本明細書に記載のFRETベースのアプローチを示しています。約41Aは、FRETを受けて対応する二つの蛍光団を分離する短い距離に注意してください。フルオロフォア-マレイミドのためのアクセプター部位は、緑と赤で示されている。（B） インサイチュでのTCRのpMHC相互作用を検出する原理が示されています。のみのscF Vは特定の複合体を形成するTCRとpMHCs（ここではIEのk）を 、-decorated、測定可能なFRETシグナルを生じさせる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> &quot;/&gt; 図のscF Vの単量体およびペプチド負荷IE kの-2x6H分子に最終ゲル濾過工程生じさせる3.クロマトグラム。X軸はミリリットルでの保持容量を表し、Y軸は任意の単位で280 nmで（AU）の吸光度を示します。（A）H57のscF Vの部位特異的にアレクサフルオロ555マレイミドで標識したタンパク質は、（ステップ1.2.5）からの未反応染料を分離するために、S75クロマトグラフィーに付しました。間隔14〜15ミリリットル（破線）を保持するために対応する画分を標識した単量体H57のscF Vを表しています。UV-切断可能なANP空間ホルダーペプチドと複合体を形成する分子は、UV照射、部位特異的にアレックスと一緒にインキュベートされていた-2x6H（B）IEのK 647マレイミド標識ペプチド、最終的に遊離ペプチド（ステップ1.1.2.4）からタンパク質を分離するためにS200クロマトグラフィーに供しました。破線の間隔が適切に折り畳まれ、単量体pMHCsが含まれています。（A、B） </strong&gt;は0.7ミリリットルのサンプルは、ラム酒（0ミリリットル点）の開始時にカラムに適用しました。集めた画分を濃縮しました。タンパク質対色素比は（-20°で保存）、PBS / 50％グリセロールに対して透析前にphotospectrometryによって決定した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig4.jpg" /> 図4の決定2D-K D SとS の 2D-K。（A）、アクセプター漂白及びTCR占有が実験的に測定したドナーの回復によって決定されるように、FRETの収量との相関関係。セクション4.2で説明したように、TCRの占有率は、個々のTCRマイクロクラスターについて決定することができます。データの線形適合が線で表示されている、の傾きは、TCRとの比Cに等しいです。占有とFRET収率。Cが採用FRET系のための一定の特定およびフルオロフォア（ここでのCy3およびCy5）です。この例では、（B）1.988を得た収率データは、個々のTCRマ ​​イクロクラスターについて決定したFRET（N = 187、温度= 24℃）アクセプター漂白の供与体を介して回収。ヒストグラムの棒の下の数字は、区間内の上限値を示す。（A）で決定された定数 Cと測定されたFRETの利回りを乗じて（B）に示したデータの（C）変換 。バーの下の数字は、区間内の上限値を示している。（D）ヒストグラム（半対数、ベース= 4）個々のTCRマ ​​イクロクラスターについて測定した2D-K D Sの分布を示しました。中央値は、2D-K D が青色で表示されます。バーの下の数字は、（E）（D）に示すヒストグラム。区間内の上限を示すint型に変換されました-histogram 上のOA 2D-K（半対数、ベース= 4）24℃（0.41秒-1）のためのオフシナプスKを採用。値の決定の中央値の2D-Kが青色で表示されます。データはもともとHuppa らに出版された。2、ここに新しい形式で可視化されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig5.jpg" /> T細胞刺激およびイメージングのために使用のSLBの図5の機能検証。 FURA-2を搭載した（A）TCRトランスジェニックT細胞ブラストは、抗原pMHCs、ICAM-1およびB-7を保有刺激SLBに直面しました。携帯電話340 nmおよび380 nmで励起されたFURA-2排出量だけでなく、DIC画像を記録しました。示されるように、発光強度の比の値は34で励起0と380 nmのは、右側のパネルに表示されます。実験に抗体14分を遮断するのpMHCの添加は、休止T細胞のそれに匹敵する細胞内カルシウムレベルが減少した。（B）刺激のSLBを接触させ、T細胞の平均FURA-2比の典型的な時間的プロファイルを特徴としています抗体媒介遮断後の抗原を奪われた非活性化T細胞またはT細胞に比べ2~4倍高い細胞内カルシウムの立ち上がりによる。グリーンの円は、（A）に示した時点を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig6.jpg" /> 図6は、バルクFRETアクセプター漂白後のFRETドナー回収を通して測定される収率をFRET。 <strオング&gt;（A）図は、典型的なシナプスのFRET測定の一例です。左側に、トップに表示されるように一連の画像は、FRETドナーとFRETアクセプターチャネル（ビームスプリッタの詳細については、Axmann ら 4を参照）を生じさせる放射ビームスプリッタを使用して取得されました。左DICの画像に示す線は、T細胞のシナプスの境界を示します。 （B）ならびにFRETアクセプター漂白（ステップ4）の後にFRETドナーチャネル中の強度の増加はFRETアクセプターチャネル内の強度の損失を注意個々のシナプス領域または全体シナプスために示されているように効率を定量化することができるFRET。検査のために、FRETアクセプター漂白前と後の画像は2つのルックアップテーブル（LUT、緑と物理学）を使用して示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> </p&gt; <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig7.jpg" /> 図7.単一分子は、イベントが表示され、insingleステップを消え、完全に単一のFRETアクセプターフルオロフォアで整列されている。単一分子FRETイベントの時間経過が示されているFRET。画像は、裏面照射型EMCCDカメラを用いて得た。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig8.jpg" /> H57のscF V -AF555由来観察可能なFRETシグナルのオフ = 1 / K測定smFRET軌道からオフ τの決定図8（A）の正規化累積和は、（IEの&lt;認識5c.c7 TCRトランスジェニックT細胞ブラストを飾っSUP&gt; / K3-AF647は、4つの異なるタイムラグ（42ミリ秒、490ミリ秒、1007ミリ、1989ミリ秒）のため24℃）での観測の合計数の関数としてプロットしたK。単一指数フィット関数が。期待値&lt;N（T ラグ ）&gt;の負の逆数に対応を生じさせる（B） の期待値は遅延tの遅れに対してプロットし、&lt;N（T 遅れ ）&gt;式を用いて適合=τ オフ / {（τ オフ / &lt;N 漂白 &gt;）+ T 遅れ }τをオフに生成すると、&lt;nは漂白剤 &gt;。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

TCR-のpMHCが結合を測定します<em&gt;その場で</em&gt; FRETベースの顕微鏡アッセイを使用して

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

measuring-tcr-pmhc-binding-in-situ-using-a-fret-based-microscopy-assay

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

12.2K ビュー.  Vienna University of Technology. This manuscript describes how to conduct (single molecule) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer. 