ここでは、マイクロバイオームに対するグリホサートの効果を評価するための実験を実施するための最良のバイオインフォマティクス方法を含むワークフローを提供します。主な利点は、将来のフィールドおよびラボ実験のための堅牢なテスト可能な仮説を提供することです。説明されている方法論は、植物、動物、および微生物を含む様々な系に適用することができる。
方法論の各部分は非常に簡単です。おそらく最も困難な部分は、作業のさまざまな部分を実行できる学際的なチームを統合することです。手順を実演するのは、私の研究室の研究者であるSuni Matthewです。
まず、実験フィールドを、プロット間に植生のバッファーストリップを使用したコントロールとGBP処理の10回の反復に分割して、実験1を開始します。対照プロットを水道水で処理し、GBPプロットを市販のGBPで処理して、農業慣行において許容される最大グリホサート投与量を模倣する。実験植物から微生物叢をサンプリングする。
畑から植物サンプルの10の複製を収集し、すぐに氷の上に置き、さらなる処理のために実験室に持ち込む。実験2では、12ヶ月間の鳥小屋実験で、GBP汚染または対照飼料を食べたウズラから木材削りくず、糞便、およびこぼれた飼料を含む寝具を収集します。寝具サンプルを、グリホサート濃度測定のために認定ラボに送付し、広げた直後に行います。
各プロットに多年生草とイチゴの植物を植えて、それらの根と葉の微生物叢を研究します。植物サンプルを洗浄および滅菌することによって、内生微生物を同定し、除去する。サンプルが滅菌されたら、メーカーのプロトコールに従って市販の植物DNA抽出キットを使用してゲノムDNAを抽出します。
ネストされたアプローチを使用して、16S rRNA遺伝子の可変領域V6~V8を増幅し、テキスト原稿に記載されているように、必要な数のサンプルに対してPCRマスターミックスを作成します。PCRの第1ラウンドでは、前方に799、逆に1492のプライマーを使用します。サーモサイクラーで増幅プロファイルを35サイクル設定します。
増幅を検証するには、5マイクロリットルの増幅産物を用いて電気泳動を行い、PCR産物の残り25マイクロリットルをオートクレーブ処理した超純水で1対10の割合で希釈する。順方向のユニバーサルプライマー1062および逆方向の1390を用いて、25サイクルで第2ラウンドの増幅を行う。得られたPCR産物をオートクレーブ処理した超純水で等価比で希釈する。
8サイクルで増幅の第3ラウンドを実行し、バーコードとP1アダプタシーケンスで製品にタグを付けます。バイオアナライザーでPCR産物の品質濃度を検証し、各サンプルのDNA30ナノグラムを構成する量を1.5ミリリットルのチューブにプールして等モルライブラリーを作製した。アガロースゲルカセット上の自動DNAサイズ選択システムを用いたサイズ分画によって、サイズ350〜550塩基対のアンプリコンを選択する。
指定されたサイズのアンプリコンを含む溶出液をカセット内のバイアルに集め、精製された16S rRNA遺伝子ライブラリーを得る。回収した溶離液を1.5ミリリットルのチューブに移し、バイオアナライザーで純度と濃度を検証します。オートクレーブ処理した超純水を用いてDNAライブラリーを終濃度26ピコモルに希釈する。
ITS領域を増幅するために、ITSプライマーによる反応を設定した後、増幅プロファイルをサーモサイクラー上に設定した。次いで、増幅産物5マイクロリットルを1.5%アガロースゲル上で分析し、オートクレーブ処理された超純水を用いて、残りの25マイクロリットルの生成物を1対10の割合で希釈する。バーコードタグ付きフォワードプライマーおよびP1アダプタータグ付きリバースプライマーを使用して、必要なサンプル数のPCRマスターミックスを作成します。
希釈したPCR産物を鋳型として用い、第2ラウンドの増幅を行う。16S rRNA遺伝子のライブラリー調製と同様に、精製ITS領域用のライブラリーを準備する。EPSPSタンパク質配列のバイオインフォマティクス解析を開始します。
サーバー提供出力からのグリホサートに対するクエリ配列の潜在的な感受性を評価し、出力1はクエリ配列中に存在するアミノ酸マーカーの割合およびモチーフの数を示す。出力2は、マーカー残基に基づくクエリーおよび参照配列のアラインメントを示す。出力 3 は、クエリー・シーケンスと参照シーケンスの完全なペアごとのアラインメントを示しています。
出力4は、コレラ菌、コクシエラ・バーネティイ、ブレブンジモナス・ベシキュリス、およびストレプトマイセス・ダバウェンシスのEPSPS参照配列を示す。出力ページの最後に、BLASTp や保存されたドメインなどの外部ツールへのリンクを見つけて、クエリ EPSPS シーケンスをさらに分析します。パブリック リポジトリから EPSPS シーケンスを特定したら、分類情報を含む EPSPS クラス サーバーのメイン ページと、50,000 を超えるシーケンスの EPSPS クラスからこれらのデータセットにアクセスします。
圃場シーズンの終わりに植物の地上バイオマスを計量し、GBPプロットと対照プロットで植物の成長を比較します。スプレッドシートで、マイクロバイオーム実験用の細菌OTUを事前に計算されたデータセットにマッピングします。確率的スコアに基づいて、グリホサートに対する固有の感受性を計算する。
この方法は、EPSPSタンパク質の感受性の変化を微小進化レベルで定量するために使用された。我々は、分析された原核生物の32の密接に関連したグループのうち12において感受性状態の変化を同定した。したがって、グリホサートベースの製品'連続使用は、植物、動物、および土壌マイクロバイオームにおいて微生物嚥下障害を生じさせる可能性がある。
PCR前およびPCR後の手順の品質を確保して、最適なアンプリコンライブラリーを取得します。また、ソフトウェアを使用する前に、EPSPSタンパク質配列が部分的ではないことを確認してください。野外実験では、グリホサートによるコントロールの汚染を確実に防いでください。
