このプロトコルでは、非標的メタボロミクス分析中にアルファルファに対する生体異物の影響を評価する方法について説明します。この技術は非常に単純で操作に便利であり、より多くの種類の根滲出液を特定することができます。これは、植物の根の滲出液のメタボロームフィンガープリントを構築するのに役立ちます。
メディカゴサティバまたはアルファルファ種子の滅菌は、種子を0.1%次亜塩素酸ナトリウムで10分間すすぐことから始めます。続いて、75%エチルアルコールで30分間洗浄した。次に、滅菌した種子を蒸留水で数回すすいでください。
そして、滅菌シャーレに入れた湿ったろ紙の上でそれらを発芽させます。暗闇の中で摂氏30度で。発芽後、均一に発芽した大きなふっくらとした種子20個を、栄養液で満たされた培養瓶の生着バスケットに移します。
すべての培養ボトルを、制御された条件を持つ成長チャンバーに入れます。2週間後、15本の均一なアルファルファ苗を新しいガラス瓶に移し、培養実験のために1キログラムあたり1ミリグラムと1キログラムあたり10ミリグラムのDEHPストレスにさらします。DEHPの光分解と揮発を防ぐために、処理および制御ガラス瓶をアルミホイルとパラフィルムで包みます。
液体レベルを維持するために、毎日栄養溶液を補給します。アルファルファの苗の一貫した成長条件を確保するために、2日ごとにボトルをランダムに配置して回転させます。7日間の栽培後、アルファルファの苗をボトルから取り出します。
そして、それらを超純水で数回洗浄して、根の滲出液の収集に備えます。10ミリリットルの滅菌脱イオン水で満たされた遠心分離管に50個の均一なアルファルファ苗を移すことによって、根の滲出液収集実験を開始します。根の滲出液を集めるには、根を水に浸した状態でチューブを6時間直立させます。
完了したら、遠心管をアルミホイルで包み、根を光から保護します。植物を取り除き、代謝物プロファイリングのために集めた液体を凍結乾燥します。凍結乾燥サンプルに1.8ミリリットルの抽出溶液を加えて抽出実験を進めます。
30秒間渦で。次に、氷水浴中で10分間超音波をチューブに当てる。サンプルを遠心分離する前に。
200マイクロリットルの上清を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに慎重に移します。遠心チューブから45マイクロリットルの上清を吸引し、最終容量270マイクロリットルで品質管理またはQCサンプルに混合します。完了したら、真空濃縮器で抽出物を凍結乾燥します。
乾燥が完了したら、5マイクロリットルの内部標準リボヌクレアーゼを加え、乾燥を続けます。蒸発後、30マイクロリットルのメトキシアミノ化塩酸塩溶液を加え、チューブを摂氏80度で30分間インキュベートします。次に、40マイクロリットルのBSTFA試薬をサンプルに加え、チューブを摂氏70度で1.5時間かけて誘導体化します。
インキュベーションが終了し、誘導体化サンプルが室温に達したら、クロロホルムに溶解した5マイクロリットルの脂肪酸メチルエステルを誘導体化サンプルに加えます。30メートル×250マイクロメートル×0.25マイクロメートルのキャピラリーカラムを使用して、1マイクロリットルの根の滲出液を毎分1.0ミリリットルの流速でキャリアガスヘリウムで分離します。射出温度を摂氏280度に設定します。
また、転送ラインの温度を摂氏280度に維持します。分離用のオーブンプログラムを設定します。抽出物を分離した後、マイナス70電子ボルトのエネルギーで電子衝突モードで質量分析を行う。
イオン源の温度を摂氏250度に維持します。毎秒12.5スペクトルの速度で電荷によって50〜500質量の質量スキャン範囲でフルスキャンモニタリングモードを使用して質量スペクトルを取得します。778個のピークが対照サンプルのクロマトグラフで検出されました。
そのうち314の代謝産物が質量スペクトルに従って同定された。酸はさらに脂肪酸、アミノ酸、有機酸およびフェノール酸に細分された。さらに、根の滲出液に一般的に存在するいくつかの一般的な物質は、ピリミジン、ヒドロキシピリミジン、フラボノイド、フェノール、ケトン、ピリミジン、ジテルペンを含むアルファルファの根の滲出液からも検出されました。
異なるDEHP治療間の異なる代謝物の変動を視覚化するために、VIPスコアに基づいてヒートマップをプロットしました。対照サンプルと比較して、DEHP曝露は50の代謝産物およびアルファルファ根滲出液の含有量を有意に変化させた。主にいくつかの炭水化物と低分子量有機酸を含みます。
代謝経路解析の結果、DEHPは光合成の産物である糖質の代謝を有意に阻害することが示され、DEHPはアルファルファの光合成をある程度抑制できることが示され、DEHPはDEHPのストレスに抵抗するのに役立つ脂肪酸の代謝を促進することが見られました。正確なメタボロームデータ分析を確実にするために、少なくとも種子根の滲出液を各処理に対して実行する必要があります。.代謝差を決定し、汚染物質の環境挙動における重要なルールをさらに調査することができます。
植物とより広い分野の生物群集との間の相互作用は、主にこの方法を使用して解読することができます。
