網膜症では、血管の変化は臨床医によって検出される最初の徴候である。彼らは病気の進行に従い、これらの変化に応じて治療を選択します。いくつかの動物モデルは、病理の異なる段階を研究するために開発されています。
この研究では、異なる血管変化を測定する方法を示すつもりです。そのために、2つの動物モデルを採用します。その一つが酸素誘発網膜症マウスモデルで、未熟児網膜症と増殖性糖尿病性網膜症の一部の側面を再現しています。
ここでは、血管領域、新血管領域、および動脈の拡張とトルトオースを測定します。当研究室では、不拡散性網膜症を誘発するメタボリックシンドロームマウスモデルを開発しました。血管密度及び分岐は本研究において評価した。
マウスが犠牲を払う時、はさみで核を出す。作りたてのパラホルムアルデヒドで、生核眼を室温で1時間固定します。解剖顕微鏡の下で、手足に沿って切断してはさみで角膜を取り除き、全体のレティナを解剖します。
眼の前部を捨て、次にRPE-チョロイドからレチナを分離する。200マイクロリットルチューブにレティナを置きます。その後、5%のウシ血清アルブミントリトンを含む100マイクロリットルの結核で、シェイカーで穏やかな攪拌で4度で6時間の間にレチナをブロックし、透過させる。
次に、チューブを反転してレチナをカップに入れ、ピペットでブロッキング溶液を取り除きます。イソレクチンを含む100マイクロリットル溶液を加える。サンプルを光から保護するために、チューブをアルミホイルで包みます。
レチナを一晩4度でレクチン溶液でインキュベートし、シェーカーで穏やかな攪拌を行います。100マイクロリットルのTBSトリトンでレチナを20分間、シェーカーで穏やかな攪拌で洗います。この手順を 3 回繰り返します。
スライドにレティナを配置し、PBSを追加します。顕微鏡を解剖する下で、眼間の縁から視神経に向かって4つの等間隔の切り傷を行う。花びらを広げるには、鉗子や小さなフィルターペーパーを使用します。
感光体側が下向きであることを確認します。残りの PBS をフィルター ペーパーでスライドから取り出します。次に、取り付け中央値とカバースリップを追加します。
室温で1時間乾燥させます。光から保護された4度でスライドを保存します。共焦点顕微鏡で、スライドをプレートの下に置きます。
家臣の優れた神経叢に焦点を当て、画像取得を開始する領域を選択します。ソフトウェアで一般的なレーザーパラメータを設定します。X、Y、Z 軸の座標を設定します。
スキャンを初期化します。スキャンプロセスが完了したら、画像を開き、優先する拡張子で保存します。ImageJ FIJI ソフトウェアで、メニュー バーに移動し、[ファイル]、[開く] の順にクリックします。
処理するイメージを選択します。[バイオフォーマットインポートオプション]ウィンドウで、[OME-XMLメタデータを表示]を選択し、[OMEメタデータ]ウィンドウ OK.In クリックして、ピクセルサイズ情報を検索します。このデータをコピーします。
画像キャリブレーションの場合は、メニューバーに移動し、[イメージのプロパティ]を選択します。情報をコピーして[OK]をクリックします。イメージに優先する lut を割り当てます。1 つのイメージ内のすべてのスタックを視覚化するには、メニュー バーに移動し、イメージ、スタック、Z プロジェクトを選択します。
表示された投影ウィンドウで、船舶が視覚化されているすべてのスタックを選択します。[投影タイプ] で 、[平均強度] を選択し、[OK] をクリックします。メニューバー、画像、調整、明るさ/コントラストに移動します。[適用] をクリックして変更を保存します。
選択したパラメータをコピーして、明るさとコントラストを設定します。これらはすべての画像で同一である必要があります。メニューバーで、[杖] ツールを選択します。
形成された血管を欠いている残りの領域を選択します。キーボードの T キーを押して、ROI マネージャの選択領域を記録します。ROI マネージャで [測定] をクリックして、血管領域情報を取得します。
これらの手順を繰り返して、レティナの総面積を測定します。メニューバーで、[杖] ツールを選択します。画像を拡大して、ネオ船をより良く視覚化します。
ワンドツールでネオ容器を1つずつ選択します。キーボードの T 文字を押して、選択した領域を ROI マネージャに記録します。ROI マネージャで [測定] をクリックして、エリア データを取得します。
メニューバーで、直線ツールを選択します。画像を拡大表示して、船舶の壁をよりよく視覚化します。最初の分岐の前に、主船に3本の横線を行います。
キーボードの T キーを押して、選択した領域を ROI マネージャに記録します。ROI マネージャで [測定] をクリックして距離データを取得します。メニューバーで、マウスの右ボタンを持つ直線ツールアイコンをクリックし、[線分]を選択します。
血管の内側に線を引き、血管の形状に従って、最初の血管の影響まで視神経から。キーボードの T 文字を押して、選択した領域を ROI マネージャに記録します。メニューバーで、直線ツールを選択します。
視神経から最初の血管の影響まで線を引きます。キーボードの T 文字を押して、選択した領域を ROI マネージャに記録します。ROI マネージャの [計測] をクリックして、距離データを取得します。
メニューバーの楕円ツールを使用して、すべての実験条件に均等に適用される領域を定義します。選択した領域は視神経の周りに描かれた同心円でなければなりません。キーボードの T 文字を押して、選択した領域を ROI マネージャに記録します。
手動で、選択領域内の主な船舶から生じる一次分岐の数をカウントします。イメージを 8 ビット モードに変換します。メニューバーのプラグインに移動し、血管分析、血管密度を選択します。
容器密度を測定するメニューバーの[正方形]ツールで面積を定義します。[OK] をクリックします。プログラムは、必要な情報を含む新しいウィンドウを表示します。最初の実験例では、酸素誘導網膜症マウスモデルを採用した。
細胞内注射は、12日目に行い、抗血管新生薬としての薬剤の有効性を判定した。車両を注射したマウスを制御として採用した。血管領域は、血管の血管が欠けているゾーンとして定義されます。
取得した画像から、血管のない領域の合計として血管領域を定量化し、その全面積を細分化することができる。機械的損傷を有する領域はまた、船舶の不在を示す。損傷した領域を特定するには、Hoechst染色でニューロン層の完全性を分析します。
新血管は、優れた血管叢の既存の血管に由来する小口径血管である。我々は、新船の房が占める領域を、レティナの総面積が占めるレティナの新血管領域を定量化することによって計算した。新船の形状と大きさは可変であるため、時折、破片やアーティファクトに似ています。
新船を区別するために、房が成熟した容器から成長することを確認する。拡張の分析のために、最初の枝の前に3つの高さで主容器の直径を測定しました。研究者は、結果間の変動性を減らすために、血管径を測定するための所定の距離を定義する必要があります。
理想的には、視神経からの最も遠い点は約300マイクロメートルでなければなりません。我々は、分析を行うことを提案し、後で、条件ごとに少なくとも6匹の動物の平均を行う。トートオシティに関しては、視神経と第1分岐点の間の直線距離に関して、その形状に続く主船の走行距離を測定する。
画像で見ることができるように、主な血管のしなに異質性があります。代表的な結果を得るには、1つの条件につき6匹以下のマウスを定量化しなければならない。最新のパラメータは、血管分岐および密度、不増殖性網膜症を呈するメタボリックシンドロームモデルで分析した。
血管分岐の測定では、同心円を描いて定量化領域を定義し、中央の主な容器から生じる一次枝を1つずつ数えた。取得した画像から、血管密度を、各マイクロ写真の異なる場所に配置したROIの面積で割った血管で占める面積として定量した。機械的損傷のある領域を定量化することは避けてください。
穿刺のある領域が 3 つ以上ある場合は、その残りは破棄する必要があります。要約すると、この記事では、臨床現場で考慮される最も関連性の高いパラメータのいくつかを定量化するための古典的で確立された再現性の高い技術を示しました。
