Name: whole-mount imaging of mouse embryo sensory axon projections
Uploaded: 2014-12-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
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著者は、洞察力に富んだ議論や提案のためのTrkA taulacZマウスと博士アネットマルクス博士ルイライハルトに感謝したいと思います。この作品はバーク財団だけでなく、ホワイトホール財団研究助成金2010-08-61、ライフ財団（WFL-US-028/14）のための翼から研究助成金からスタートアップ資金によってサポートされていましたから、ZB1-1102-1を付与クリストファー＆ダナ·リーブ財団、国立眼研究所から、JZへの助成金1R01EY022409と3R01EY022409-01S1。 KJOはゴールドスミスの仲間です。

注：すべての手順は、実験動物の使用とケアのためのNIHガイドに準拠しています。動物プロトコルは、ワイルコーネル医科大学のIACUCによって承認された。 1.組織調製<ol><li>頸椎脱臼15によって時限妊娠女性を安楽死させる。冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を充填した6ウェルディッシュのウェルで個々に時限妊娠雌場所胚からE18胚 - 胚E16を解剖。 </li><li>冷PBSで胚を洗浄します。 </li><li>その後の遺伝子型判定のための事前準備されたプロテイナーゼK溶液中で胚と場所の羊膜のわずかな部分を削除します。羊膜が失われた場合あるいは、胚の尾の先端の一部を除去し、プロテイナーゼK溶液に入れ</li><li>虫ピン（側面当たり少なくとも100）を使用して、すべての胚の周りの皮膚に穴を突く。 </li><li> PBSを除去し、ゆっくりと新鮮な2％パラホルムアルデヒド（PFA）を追加し、ウェルにpHが7.4、。 </li><li>ゆっくりと4℃で2時間振る。 </li><li> PBSで2回胚をすすぎ、染色まで4℃でPBS中に保管してください。 </li></ol> 2.ジェノタイピング<ol><li>製造業者の説明書に従って、プロテイナーゼK混合物中の羊膜または胚の尾部を浸す。 </li><li> 10分間56℃でインキュベートする。 </li><li>市販のDNA精製キットを用いてDNAを抽出する。 </li><li>遺伝子特異的なセンスおよびアンチセンスプライマー（10μM）の各0.5μlの、2μLのdNTPミックスとそれを組み合わせる、ゲノムDNA溶液に精製合計200μLの0.5μLを取る（のdATP 2.5mMの、dCTP、dGTPおよびdTTP） 、0.2μlのTaqポリメラーゼ（5U /μL）と2μlのPCR緩衝液（10倍）は、20μlの総体積にH 2 Oを追加します。 注：プライマー配列は以下のとおりである（ 表1）： のTrkA：TrkA_F：GCG GGC GCC GCC、GCG ATG、TrkA_R：GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG。 PCRのFRAGメントの長さ：400塩基対（bp）の。 バックス：In5R：GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG、Ex5F：TGA TCA GAA CCA TCA TG、のNeoR：CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG。 PCR断片の長さ：野生型、304塩基対;のBaxヌル、507 bpの。 TauLacZ：lacZup：ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA、lacZdown：ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G。 PCR断片の長さ：360塩基対。 </li><li> TrkAのための以下のプログラムでPCRを実行します。72℃で30秒：68℃、ステップ4で20秒：ステップ3 95℃、10秒：ステップ1：ステップ2 95℃、1分。 40サイクル4 - を繰り返して、2を繰り返します。 <ol><li> LacZおよびBaxのために、以下のプログラムを用いてPCRを実行します。手順1：1分95℃​​で、ステップ2：10秒95℃、ステップ3：1分54℃、ステップ4：72で1分35サイクル4 - °Cを繰り返し、2を繰り返します。 </li></ol></li><li> DNAラダーのレーンで20分間、1×トリス - 酢酸-EDTA緩衝液中、100Vで2％アガロースゲル上で実行PCRサンプルフラグメントの長さを評価する。 </li><li>野生型のTrkA、Tの存在のための胚を分析RKA-tauLacZおよびBaxヌル対立遺伝子。実験的な胚の遺伝子型は、TrkAのtaulacZ / WTです：バックス- / -およびTrkAのtaulacZ / taulacZ：バックス- / - 、実験的な質問に応じて。 tauLacZレポーターを欠いている胚は軸索染色について陰性であることになるので、染色プロセスを較正するために陰性対照として役立つことができる。 </li></ol> 3.胚染色<ol><li> 3.8 -セクション3.2で下記のようにいくつかの変更を加えてLacZ染色のための市販のキットを使用してください。ここでは、ミリポアキットを使用。 </li><li>室温で穏やかに揺れ、少なくとも1時間緩衝液A中の胚を浸し。 </li><li>直接室温で静かに揺れ、少なくとも15分間、緩衝液Bで胚を浸す。 </li><li> 37℃での胚がバッファーA / Bであるが、前加温組織ベースのソリューション。胚あたりの組織塩基溶液の5ミリリットルを使用してください。 </li><li>胚は緩衝液A / Bにある間、新鮮な5-BRを準備100％のジメチルスルホキシド（DMSO）中に40mg / mlの濃度でomo-が4-クロロ-3-インドリルα-D-ガラクトピラノシド（X-galで）。 </li><li> 1 mg / mlの濃度で予め温め組織ベース溶液中にX-galで希釈し、ガラスシンチレーションバイアルにX-galを/組織ベース混合物を5ml加える。 </li><li> X-galを/組織ベースの混合物を含むガラスシンチレーションバイアルに胚を移す。パラフィルムで蓋を密封し、37℃で一晩インキュベート、ブルーステインの存在をチェックする。 </li><li>新鮮な4％PFA、pHが7.4とPostfixの胚。静かに、4℃で4時間振る。 </li><li>冷たいPBSで2回の胚をすすぐ。 </li></ol> 4.組織脱水とクリア<ol><li>ガラスバイアル中で振盪し、室温で30分間、50％メタノール/ 50％PBS混合物中の場所胚。 </li><li>ガラスバイアル中で振盪し、室温で30分間、75％メタノール/ 25％PBSで脱水し続ける。 </li><li> P 10パーセント/ 90％メタノール中で脱水し続けるガラスバイアル中で振盪し、室温で30分間、BS、。 </li><li>ガラスバイアル中で振盪し、室温で30分間（2×）、100％メタノール中で脱水し続ける。 </li><li> 1（V：V）ベンゾイルアルコール及びベンゾイル安息香酸の混合胚は、脱水されていますが、1を準備します。 注：ベンゾイルアルコール、ベンゾイル安息香酸は有毒である。 </li><li> 1：1で胚を浸す（v：v）によって精製した100％メタノールの混合物：15分間、100％BABB。 BABBはプラスチックを溶解するので、唯一のガラスを使用しています。 </li><li>完全に組織をクリアするとクリア胚におけるX-gal染色を視覚化するために100パーセントBABBで胚を浸し。 注：できるだけ早く画像のX-gal染色は、時間をかけてフェードインしますので。 </li></ol> 5.ホールマウントイメージング<ol><li>金属ピンセットを用いて写真撮影のために適切な角度で、100パーセントBABBに浸漬胚を、安定化させる。ライトアップアンダー光光源の組み合わせを用いて照明する。 </li><li>解剖顕微鏡で画像を取得するデジタルカメラを装備。 0.5ミリメートル離れてZ軸に沿って連続する5つの焦点面に複数の明視野エクスポージャーを取る。露光時間とFストップは、照明とカメラのスペックに応じて変化し、それぞれのセットアップのために最適化する必要があるかもしれません。 </li><li>オーバーレイ画像を処理し、フォトモンタージュを生成するために、標準的な画像処理ソフトウェアを使用してください。 </li></ol>

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	<li>Verze, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+innervation+in+hereditary+sensory+and+autonomic+neuropathy+type+IV.">Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV.</a> Neurology. 55, 126-128 (2000).</li><li>Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. 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The authors declare that there are no competing interests.

胚のTrkA taulacZマウスの上述のX-gal染色手順はそのまま固定胚における長距離軸索突起の迅速で詳細な視覚化を可能にする。 Baxのヌルバックグラウンドのため、これらのマウスは軸索成長とニューロンの生存の両方に寄与し得るシグナル伝達機構のプロービングが可能になります。興味のあるトランスジェニックまたはノックアウトマウスと交配すると、軸索の表現型の総合的な評価を可能にすると、より詳細な方法で軸索成長のシグナル伝達を調べるために将来の実験のためとして有用な指針を提供することができます。in vivoでの軸索成長の研究のための主要な課題は、組織を準備する時間であるセクションとは、いずれかの遺伝子操作によって複数の方法で影響を受ける可能性が増大する軸索の複雑な表現型を評価する。 TrkAのtaulacZ / taulacZ：バックス- / -ラインは、遺伝子の完全な効果を評価することができる末梢侵害受容器軸索の開発に興味のある。 技術は、通常、初期の発達段階の間にあるTrkAを発現し侵害受容​​器の軸索軌道の可視化に限定されている。末梢侵害受容器に加えて、それは、交感神経および基底前脳コリン作動性突起を可視化することが可能である。しかし、これは染色技術の特定の最適化を必要とする組織クリアがここに記載されたプロトコルの重要なステップである。それは全体のマウントの準備でより深く横たわっている凸部の詳細な評価、したがって、明確な表現型の潜在的な同定を可能にする。我々は、X-gal染色は対照的に、蛍光シグナルが中に実質的にフェードインすることを見出したので、そのようなTdTomatoまたはGFPレポーターの蛍光レポーター、18,19、特定の条件下で視覚的明瞭さを提供することができるが、しかし、それはホールマウントの画像を取得することは困難である組織清算手続き。のDiI染色も広く軸索の標識20のために使用される。その欠点は、選択的に、ここで侵害受容繊維として軸索の特定のサブタイプにラベルを付けることができないことであり、それは完全に周囲に長い軌道を標識することは困難である。 要約すると、我々は、マウス胚における侵害受容軸索の完全アーバーのルーチン視覚化できるように2遺伝子的に修飾されたマウス系統の組み合わせを使用するプロトコルを提供する。

正確な神経回路網の確立は、神経系の機能性に不可欠な複雑な発達過程である。このプロセスの乱れは、ヒトの神経系疾患1-3に関与している神経細胞の機能障害を引き起こす。哺乳動物における軸索成長および標的神経支配の下にある分子メカニズムを研究するために、我々は2つ​​の遺伝的に改変されたマウス系統の組み合わせを使用して感覚ニューロンのTrkA発現の軸索の軌道を視覚化するためのプロトコルを開発した。 のTrkAは、神経成長因子NGFに対する受容体であり、侵害受容感覚ニューロン4の機能的マーカーである。 TrkAのは非常に初期の開発中に侵害受容ニューロンに発現し、NGF依存ニューロンの生存、軸索成長、樹枝状分岐とターゲット神経支配5-9を媒介する。 TrkAのtaulacZマウスでは、野生型のTrkA遺伝子taulacZ式 cで置換されている推定上のTrkA陽性ニューロンの軸索の形態11染色のβ-gal（X-galで）によって可視化することができるようassette 10、。ヘテロ接合のTrkA taulacZ / WTラインを使用して、我々は調節またはin vivoでの感覚求心性突出部の発展を妨害する可能性のある要因を調べることができます。 また、TrkAの発現は、したがって、NGF / TrkAのシグナル伝達の非存在下でのメカニズムを促進する軸索成長を評価するために使用することができるホモ接合性のTrkA taulacZ / taulacZのマウスには存在しない。侵害受容ニューロンは、NGF / TrkAのだけでなく、軸索成長のためのシグナリングに依存するためではなく、生存のために、我々は、それ以外の細胞死からそれらを救出、胚DRGニューロンにおけるアポトーシスを阻害するために、プロアポトーシスBax遺伝子を欠いている、別のマウス系統を使用するTrkAレセプターシグナル伝達の非存在下で観察。 バックス- / -バックグラウンド12は、このように molecuが可能に特に軸索成長7-9,13-15に影響を与えるシグナル伝達経路のLAR解剖。 TrkAのでは- / - ：バックス- / -マウスは、DRGニューロンは生き残るが、皮膚の感覚求心性神経支配は完全14,15を廃止している。私たちは、選択的に軸索投射の発展にそれぞれの貢献を決定するシグナル伝達経路を活性化することができる。 バックス- / -背景： - - /またはTrkA taulacZ / WTバックス：この方法の有用性は、異なる遺伝的改変はTrkAのtaulacZ / taulacZに飼育されているときに、軸索成長表現型の変化の評価を可能にすることである。

<table><tbody><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6418</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Tech</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Rinse Solution A</td><td>Millipore</td><td>BG-6-B</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Rinse Solution B</td><td>Millipore</td><td>BG-7-B</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Stain Base Solution</td><td>Millipore</td><td>BG-8-C</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>Glass scintiallation vial</td><td>Kimble Chase</td><td>74500-20</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Labline</td><td>Model 120</td><td></td></tr><tr><td>Insect pins</td><td>FST</td><td>26000-30</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>6-well dish</td><td>USA Scientific</td><td>CC7672-7506</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td>IDT</td><td>custom DNA primers</td><td></td></tr><tr><td>Takara dNTP mixture</td><td>Takara</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>Takara LA buffer</td><td>Takara</td><td>RR002A</td><td></td></tr><tr><td>Takara LA Taq</td><td>Takara</td><td>RR002A</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Bio-Rad</td><td>DNA Engine Dyad</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-1042</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-6630</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>M205A</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Leica</td><td>DFC310FX</td><td></td></tr><tr><td>Ring light</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>MEB110</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>Photoshop 4.0</td><td></td></tr></tbody></table>

whole-mount imaging of mouse embryo sensory axon projections

胚における完全長の神経突起を可視化は、神経回路網の開発方法哺乳類の理解を得ることが不可欠である。ここでは、 その場でいくつかの遺伝子操作されたマウス系統を使用してそれらの表現型特性を評価するために、後根神経節（DRG）軸索突起のサブセットを標識するための方法を記載する。 TrkAの陽性ニューロンは、疼痛信号の送信専用の侵害受容ニューロンである。私たちは、そのままマウス胚内のすべてのTrkAの陽性末梢軸索の軌跡にラベルを付けるのTrkA taulacZマウスラインを利用しています。私たちは、さらに独立してニューロンの生存上の遺伝子操作の可能性のある影響の成長関連の質問を評価するために、本 ​​質的に神経細胞アポトーシスを廃止Baxのヌルバックグラウンド上にあるTrkA taulacZラインを繁殖。その後、関心の遺伝子改変マウスをTrkAのtaulと交配させるACZ / Baxの空行、その後、本明細書に記載の技術を用いた研究の準備ができている。このプレゼンテーションでは、マウスの繁殖計画の詳細については、解剖時のジェノタイピング、組織調製、染色および全体のマウント準備の完全長軸索軌道の可視化を可能にするためにクリアが含まれています。

TrkAのWT / taulacZの遺伝子型：たBax - / -およびTrkAのtaulacZ / taulacZ：たBax - / -胚は、明確に、標準的なPCR遺伝子型同定（ 図1）によって決定することができる。 X-gal染色ディスプレイは、従来、染色された胚（ 図2、図3a）に皮下末梢軸索アーバーを詳述し、そして組織のクリア後の胚全体（ 図3b、4）。 私たちは、TrkAのWT / taulacZを交配させています：バックス- / -ニューロン特異的ネスチンプロモーター17の制御下構成的キナーゼ活性化B-RAF（V600E）突然変異（LSL-kaBraf 16）を有するマウスを持つ行が、取得しLSL- kaBraf：TrkAのtaulacZ / taulacZ：バックス- / -マウス。完全にTrkAのシグナリングを欠いているこれらの胚では、侵害受容器周辺凸部の形態は、それにもかかわらず、ほぼ正常にします（ 図4）を開発しました。この実証saのB-RAFのための重要な機能は、周辺軸索成長シグナリング、またTrkAのシグナル伝達の機能を促進する生存および軸索成長のBaxと、分離することができることを示している- / -遺伝的背景シグナリングTrkAの依存性の生存の喪失を置換する。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52212/52212fig1highres.jpg" /> 図1：トランスジェニックマウスのジェノタイピング代表アガロースゲル画像。サンプル1：TrkAのWT / taulacZ：BaxのWT / - 、サンプル2：TrkAのtaulacZ / taulacZ：バックス- / - 、サンプル3：TrkAのWT / taulacZ：バックス- / - 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52212/52212fig2highres.jpg" /> 図2：E18.5のTrkA WT / taulacZマウスは、X-galで染色三叉神経節からの軸索投射を胴体とHEAに。Dはクリアされていない胚に示されている。スケールバー：1ミリメートル。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52212/52212fig3highres.jpg" /> 図3：E18.5のTrkA WT / taulacZの前のX-gal（A）で染色したマウスと半ば胴体内のDRGからBABB突起をクリアした後（B）が示されている。スケールバー：2ミリメートル。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52212/52212fig4highres.jpg" /> 図4：E16.5 LSL-kaBraf：TrkAのtaulacZ / taulacZ：バックス- / - ：X-galで染色し、BABB kaBraf でクリアネスチンのCreマウス胚は、キナーゼ活性化B-RAFキナーゼタンパク質をコードして、B-RAF V600E。 DRGニューロンにおけるKAB-RAFの発現は、TrkAのシグナリングがない場合の通常の軸索伸長に近い、完全長になった。スケールバー：1ミリメートル。コントロールを含む複数の画像については、リファレンスを参照してください。 15、 図2。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> PCR遺伝子型同定のために使用したプライマー</td></tr><tr><td rowspan="3"> 1 </td><td>のTrkA </td><td> DNA断片サイズ：400bpの</td></tr><tr><td> TrkA_F </td><td> GCG GGC GCC GCC、GCG ATG </td></tr><tr><td> TrkA_R </td><td> GAA GCC GCC TGCのGCG GCT CTG C​​CA GGG TG </td></tr><tr><td rowspan="4"> 2 </td><td>バックス</td><td> DNA断片のサイズ：304 bpの（野生型）、507 BP（のBaxヌル） </td></tr><tr><td> In5R </td><td> GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG </td></tr><tr><td> Ex5F </td><td> TGA TCA GAA CCA TCA TG </td></tr><tr><td>のNeoR </td><td> CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG </td></tr><tr><td rowspan="3"> 3 </td><td> TauLacZ </td><td> DNA断片のサイズ：360 bpの</td></tr><tr><td> lacZup </td><td> ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA </td></tr><tr><td> lacZdown </td><td> ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G </td></TR&gt; </tbody></table> 表1：PCR遺伝子型同定のために使用したプライマー。

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Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

マウスの胚感覚軸索投影のホールマウントイメージング

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

whole-mount-imaging-of-mouse-embryo-sensory-axon-projections

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.0K ビュー.  Weill Medical College of Cornell University. We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

ビデオ: Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in which the enhanced version of the green fluorescent protein (EGFP) is exclusively expressed in all neurons of the developing central and peripheral nervous system1, allowing the possibility to both film the innervation of the forelimb and to manipulate this process with pharmacological and genetic techniques2. The most critical parameter in the successful cultivation of such slice cultures is the method by which the slices are prepared. After extensive testing of a variety of methods, we have found that a vibratome is the best possible device to slice the embryos such that they routinely result in a culture that demonstrates viability over a period of several days, and most importantly, develops in an age-specific manner. For mid-gestation embryos, this includes the normal outgrowth of spinal nerves from the spinal cord and the dorsal root ganglia to their targets in the periphery and the proper determination of skeletal and muscle tissue. 
In this work, we present a method for processing whole embryos of embryonic day (E) E10 to E12 into 300 - 400 micrometer slices for cultivation in a standard tissue culture incubator, which can be studied for up to two days after slice preparation. Critical for the success of this approach is the use of a vibratome to slice each agarose-embedded embryo. This is followed by the cultivation of the slices upon Millicell culture membrane inserts placed upon a small volume of medium, resulting in an interface culture technique. One litter with an average of 7 embryos routinely produces at least 14 slices (2-3 slices of the forelimb region per embryo), which varies slightly due to the age of the embryos as well as to the thickness of the slices. About 80% of the cultured slices show nerve outgrowth, which can be measured througout the culturing period2. Representative results using the tauGFP mouse line are demonstrated.

We present a method to prepare organotypic slices of mid-gestation mouse embryos for the cultivation and time-lapse imaging of peripheral nerve outgrowth.

末梢神経突起伸長のリアルタイムイメージングのためのGFP発現マウス胚の器官型スライス培養

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

神経科学

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

共焦点光シート顕微鏡全体マウスの脳のミクロンスケールの分解能光トモ

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

発生中のマウス胚性皮質における有糸分裂のライブイメージング

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

キセノプス・レービス胚における眼芽へのDNAのマイクロインジェクションとGFPのイメージングは、無傷で光学軸軸樹園を発現し、生きているキセノプス・タマジャクシ

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

発生生物学

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

マウス皮膚や毛包パターニングおよび感覚軸索形態の解析への応用のフラットマウントイメージング

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a wide range of techniques encompassing ex vivo and in vitro approaches. However, most studies still rely on the analysis of two-dimensional (2D) imaging data, which limits proper evaluation of a developmental process like axial extension and somitogenesis involving highly dynamic interactions in a complex 3D space. Here we describe techniques that allow mouse live imaging acquisition, dataset processing, visualization and analysis in 3D and 4D to study the cells (e.g., neuromesodermal progenitors) involved in these developmental processes. We also provide a step-by-step protocol for optical projection tomography and whole-mount immunofluorescence microscopy in mouse embryos (from sample preparation to image acquisition) and show a pipeline that we developed to process and visualize 3D image data. We extend the use of some of these techniques and highlight specific features of different available software (e.g., Fiji/ImageJ, Drishti, Amira and Imaris) that can be used to improve our current understanding of axial extension and somite formation (e.g., 3D reconstructions). Altogether, the techniques here described emphasize the importance of 3D data visualization and analysis in developmental biology, and might help other researchers to better address 3D and 4D image data in the context of vertebrate axial extension and segmentation. Finally, the work also employs novel tools to facilitate teaching vertebrate embryonic development.

Here, we describe computational tools and methods that allow visualization and analysis of three and four-dimensional image data of mouse embryos in the context of axial elongation and segmentation, obtained by in toto optical projection tomography, and by live imaging and whole-mount immunofluorescence staining using multiphoton microscopy.

脊椎動物の軸の伸びとセグメンテーションを研究するための3次元および4次元の可視化と解析アプローチ

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

胎児運動ニューロンの軸索突起パターンの視覚化<em&gt;ショウジョウバエ</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in vertebrates. Thus, it is critical to uncover the molecular mechanisms of how motor axons navigate to, arborize, and innervate their peripheral muscle targets during development and degeneration. Although transgenic Hb9::GFP mouse lines have long served to visualize motor axon trajectories during embryonic development, detailed descriptions of the full spectrum of axon terminal arborization remain incomplete due to the pattern complexity and limitations of current optical microscopy. Here, we describe an improved protocol that combines light sheet fluorescence microscopy (LSFM) and robust image analysis to qualitatively and quantitatively visualize developing motor axons. This system can be easily adopted to cross genetic mutants or MN disease models with Hb9::GFP lines, revealing novel molecular mechanisms that lead to defects in motor axon navigation and arborization.

Here, we describe a protocol for visualizing motor neuron projection and axon arborization in transgenic Hb9::GFP mouse embryos. After immunostaining for motor neurons, we used light sheet fluorescence microscopy to image embryos for subsequent quantitative analysis. This protocol is applicable to other neuron navigation processes in the central nervous system.

モーター軸索ナビゲーションと光シート蛍光顕微鏡を用いたマウス胚における軸索分枝の定量化の可視化

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

マウス大脳皮質における細胞組織の大規模三次元イメージング

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

発生中のマウス脳における神経細胞およびグリア細胞の動態の可視化

Time-Lapse Imaging of Migrating Neurons and Glial Progenitors in Embryonic Mouse Brain Slices

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain surface. This process is crucial for proper brain function, and its dysregulation can result in neurodevelopmental and psychiatric disorders after birth. In fact, many genes responsible for these diseases have been found to be involved in this process, and therefore, revealing how these mutations affect cellular dynamics is important for understanding the pathogenesis of these diseases. This protocol introduces a technique for time-lapse imaging of migrating neurons and glial progenitors in brain slices obtained from mouse embryos. Cells are labeled with fluorescent proteins using in utero electroporation, which visualizes individual cells migrating from the ventricular zone with a high signal-to-noise ratio. Moreover, this in vivo gene transfer system enables us to easily perform gain-of-function or loss-of-function experiments on the given genes by co-electroporation of their expression or knockdown/knockout vectors. Using this protocol, the migratory behavior and migration speed of individual cells, information that is never obtained from fixed brains, can be analyzed.

著者スポットライト:発達中の脳における細胞移動と遺伝子の役割の探索

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain surface. Many genes are involved in this process. This protocol introduces the technique for the time-lapse imaging of migrating neurons and glial progenitors.

マウス胚脳切片における移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージング

During the development of the cerebral cortex, neurons and glial cells originate in the ventricular zone lining the ventricle and migrate toward the brain ...