この全マウント解剖および分析ワークフローは、個々の味覚神経アーバーの完全な形態を分析する新しいアプローチを提供し、細胞型の数を伝達し、細胞間の物理的関係を示す。全体の言語上皮を収集すると、細胞の絶対数と全体の味覚芽内のインナーブの体積を測定することができます。このアプローチは、セクションからのサンプリングに基づくセル構造の推定値よりも正確であり、技術的な変動性を低減します。
これはまた、その内インレーションに関連して味覚芽細胞の詳細な分析を提供する最初の方法です。この方法は、味覚芽内の潜在的な回路、ならびに正常な味覚機能を破壊する疾患プロセスおよび化学療法に関する調査を強化することができる。ほとんどの場合、どの構造や関係が中断されるかは不明であるため、これらの要因をすべてそのまま維持することで、単一の準備内のすべての分析が可能になります。
最も一般的な間違いは、上皮の下側に十分近い解剖しないことによって上皮を損傷することを避けようとしています。組織の型の組織を凍結する前に、できるだけ多くの下層組織を除去することが不可欠です。また、上皮が組織の金型の底に平らに横たわっていることを確認することも重要です。
0.1モルリン酸緩衝液で舌を解凍し、すすいでから始めます。次に、真菌形態乳頭を含む前舌の1/2を、解剖顕微鏡下のガラススライドに置きます。鈍い鉗子および解剖はさみを使用して筋肉を取り除き、リングアル上皮が湾曲しているように組織を開いたままにし、粗い解剖用はさみの刃を上皮に平行に保つことによって組織の平らな配向を保障する。
それは味覚芽が含まれているので、舌の腹側非角化上皮を捨てます。その後、角化上皮の下側に近い解剖のために細かい解剖はさみを使用してください。鈍い終わりの鉗子を使用して上皮の一部を組織型に置き、平らに横たわるようにします。
その後、最適な切断温度化合物(OCT)の滴を組織に加えます。組織モールドを解剖スコープの下で以前に冷却された金属ベースに置き、OCTが凍結するまで鉗子で組織を軽くタップし続け、組織ができるだけ平らに凍結することを保証する。OCT が凍結したら、すぐに追加の OCT を追加し、冷却した 2-メチルブタンのビーカーに金型を凍結するまで置きます。
OCT金型をクライオスタットに取り付け、20ミクロンのセクションに切ります。各セクションを収集し、上皮の基部に近い評価を行うために、それを光顕微鏡の下で見ます。上皮の下側から組織を剃った後、上皮を解凍し、シェーカー上の0.1モルPBで2回する。
硬口蓋前を柔らかく硬い口蓋の接合部に切り、その後、軟口蓋を下の組織から分離し、残りの骨片が切り取られ、追加の筋肉および結合組織を除去する。鈍い終わりの鉗子で口蓋を保持し、残りの腺を取り除き、カミソリの刃でそれらを穏やかに掻き取ることによって結合組織を失う。全体の味覚芽およびすべての味覚芽の内インベーションをPhox2b-Cre TdTomatoマウスにおいて、DsRedおよびケラチン8の抗体でリンガル上皮を染色することによって標識した。
味覚芽量を測定し、真菌形態または円周測定領域のいずれかで味覚芽量とインナレーション量との間に相関関係を明らかにされなかった。TrkB CreER TdTomatoマウスにおけるタモキシフェンの低用量の投与は、遺伝子組み換えおよび少数のニューロンの標識を引き起こす。全体マウント味覚芽を、炭酸脱水酵素4とホスホリパーゼCベータ2との味転生細胞マーカーで染色した味覚を有する芽を示す。
この味覚芽は、繊維を再構築した後に取り除かれた味覚芽で示されている2つのラベル付き端子アーバーを有する。細胞ピクセルベースのイメージングソフトウェアを使用して、神経線維と味のトランスデューシング細胞の間の最も近い近接を決定すると、19の味のトランスデューシング細胞のうち、青色末端アーバーが水色の炭酸脱水酵素4plus細胞の200ナノメートル以内にあったことが明らかになった。緑色のトレースに関連する末端のアーバーはマゼンタで示され、光と濃い青色の両方の炭酸脱水酵素4プラスセルの200ナノメートル以内です。
全型ケラチン8および5-エチニル-2'デオキシウリジンまたは真菌形態の味覚芽のEdU染色は、EdU標識細胞が味覚芽の内外に存在していたことを明らかにした。マゼンタと紫の核は、味覚芽のケラチン8プラスボーダーの外側で観察されます。黄色、ティール、青の細胞は味覚芽の中にありました。
このプロトコルを試みるとき、組織解剖および凍結ステップは極めて重要である。これらの組織解剖方法は、様々な細胞および構造の染色を行い、味覚芽内と味覚芽の外側の両方の関係を分析するが、乳頭内で行うことができる。これは、味覚芽内の全体の味覚樹ボールの最初の分析だけでなく、味のトランスデューシング細胞との関係です。
これらの要素の一部を1つの調製で保存し、染色することで、分析の可能性が広がり、可能な測定が絞り込まれます。
