ウォータージェット技術によるブタ脂肪組織由来間質細胞の注入

液体、ナノ粒子、微粒子、封入薬物、さらには生細胞などの活性成分のウォータージェット注射は、標的とする異なる組織における針状注射と比較して、はるかに正確に適用することができる。低侵襲アプローチでは、注射圧力を事前に選択することによって、標的組織の所定の層における薬物の正確な局在化が必要である。私たちの現在の焦点は、尿失禁のための細胞療法です。

しかし、この技術は、重度の心臓発作後の感染した筋肉組織の再生にすでに拡張されている。現在、この技術は、前臨床試験において経験豊富な研究者または認可された医師のみが適用することができる。将来の臨床目的のために開発されているため、日常的な実験室手順で使用することを意図したものではありません。

まず、成体の雌のランドレースブタから解剖した接続膀胱で尿道を、骨盤底下部の弾力性を模倣したスポンジの上に置きます。次に、膀胱を使用して、尿道の向きを決定する。これは、腹腔および骨盤腔内の膀胱を固定する尿管および3つの靭帯の局在化のために可能である。

尿道を正しく向けた後、カテーテルの助けを借りて背側で縦方向に切り開きます。ブタ脂肪組織由来間質細胞の細胞密度を1ミリリットル当たり10~6個目の細胞の2.4倍に調整した後、緑色蛍光膜透過性生細胞染色剤で細胞を標識し、次いで細胞懸濁液をシリンジで吸引し、ウィリアムズ細胞鏡注射針を塗布する。次に、15ミリリットルの遠心チューブ内の2ミリリットルの成長培地のすぐ上に針を保持するか、開いた尿道組織に針を挿入します。

どちらの場合も、250マイクロリットルの細胞懸濁液を手動で注入する。注射ドームから死体尿道に注入された細胞。培地に注入した細胞を遠心分離により直接集める。

死体尿道に注入された細胞の場合、注射器に塗布された18ゲージの針で注射ドームからそれらを吸引する。吸引した細胞を遠心チューブに移し、遠心分離によりペレット化する。両方の細胞ペレットを4ミリリットルの成長培地に再懸濁する。

細胞収量および生存率を決定するために、20個の細胞懸濁液を20マイクロリットルのトリパンブルーと十分に混合する。次いで、この混合物の10マイクロリットルを血球計器の各チャンバーに充填する。顕微鏡下で、四隅の四角すべての細胞を数えます。

染色されていない白色細胞を生細胞として、青色染色された細胞を死細胞としてカウントし、ミリリットル当たりの細胞数を計算する。ウォータージェットを介した注射の場合、ブタ脂肪組織由来間質細胞の密度を1ミリリットル当たり10~6細胞の6倍に調整する。先に示したようにそれらをラベル付けし、無針ウォータージェット装置の投与ユニットに細胞懸濁液を充填する。

次いで、噴射ノズルを15ミリリットルの遠心チューブ内の2ミリリットルの成長培地のすぐ上または開いた尿道組織の少し上に保持する。どちらの場合も、100マイクロリットルの細胞懸濁液を注入する。組織浸透には高圧を使用し、続いて細胞注射には低圧フェーズを使用します。

死体尿道に注入された細胞は、注射ドームを形成する。培地に注入した細胞を遠心分離により直接採取する。死体尿道に注入された細胞については、注射ドームから吸引する。

吸引した細胞を遠心チューブに移し、先に示したように遠心分離を用いてペレット化する。遠心分離後、両方のペレットを4ミリリットルの成長培地に再懸濁する。注射後に取り出した細胞を組織培養皿に5倍の密度で10~5個の細胞を1皿あたり5個に播種する。

摂氏37度で3時間インキュベーションした後、AFM測定の直前に、成長培地をL-グルタミンを含まない3ミリリットルのLeibovitzのL-15培地と交換する。個々の細胞の弾力性を測定するには、1つの細胞を視覚的に識別し、それに焦点を合わせます。次に、コンピュータマウスをセルの中央に配置し、測定精度を向上させるために、AFMチップをセル核の真上に配置します。

次に、片持ち梁に焦点を合わせ、コンピュータのマウスで動かします。その後、runで測定を開始し、少なくとも50個のセルを測定します。片持ち梁の校正により得られた設定点パラメータを用い、1つのセルを3回測定する。

ウィリアムズ針を介して送達された細胞の生存率は、E60-10設定を用いたウォータージェットによる注射よりも高かった。捕捉液中の注射の生体力学的評価は、ウィリアムズ針注射は対照と比較して弾性率に有意差を示さなかったことを明らかにしたが、ウォータージェット注射は細胞弾性率を40〜50%有意に低下させた同様に、死体尿道組織サンプルにおいて、ウィリアムズ針注射は対照と比較して細胞弾性率に有意差をもたらさなかった。しかし、ウォータージェット注射後に51%の有意な減少が観察された。

針注射が怪我をしている組織に完全に浸透していないことを確認するだけです。ウォータージェットでは、デバイスを注入領域の正しい位置に配置するだけでよく、残りはデバイス自体によって自動的に行われます。ウォータージェット装置は、内視鏡装置に適合し、適合するように開発されたので、組織を再生し、修復作業を行うために、これらの膀胱鏡または内視鏡技術によって到達することができる体内の任意の部位のためのウォータージェットアプリケーションを使用することができます。