角膜の透明度は、視力をクリアするのに役立ちます。病理学的文脈では、この透明性は挑戦的であり得る。病因メカニズムを研究するには、ヒトの臓器と高い類似性を有する単純なモデルが必要である。
これらの側面において、ゼブラフィッシュは優れたモデルである。そして、これはゼブラフィッシュの角膜擦過傷の最初の詳細な説明です。この技術は、眼への表面侵入を誘導する簡単で迅速な方法である。
創傷閉鎖は、擦過傷後に容易に追跡することができる。また、化学物質、または特定の要因をタンク水に追加して、創傷閉鎖への影響を調べることができます。創傷は手動で作成されるので、この方法は一貫した結果を得るためにいくらかの練習を必要とする。
実験の前に、トリカインの0.02%作業溶液を調製する。0.4%ストック溶液2mLを解凍する。40mLのシステム水を加える。
そして、溶液を小さな容器に入れます。バリの先端がきれいかどうかを確認して、眼科用バリを準備します。そして必要に応じて、湿った綿棒で細胞の破片を取り除きます。
柔らかいスポンジの側面に切開を行います。そして、スポンジをシステム水で湿らせます。スポンジを解剖顕微鏡のステージに置きます。
バリを使用するための十分な作業スペースを確保します。そして、目の表面を正しく見るために側面と上からの十分な照明。頭をスポンジ表面から突き出した状態で、スプーンで麻酔した魚をスポンジの切開部にそっと置きます。
バリの先端で目元に慎重に近づきます。そして眼面上の先端を円運動で動かし始める。擦り傷が終わったら、回復のために鎮痛剤を含む淡水に魚を慎重に置きます。
使用後すぐにバリを湿った綿棒で拭いてください。目的の時点で魚を拾い上げ、0.02%トリカイン溶液に入れます。操作の動きが完全に止まり、魚が触れることに反応しなくなるまで、動物を溶液に入れたままにします。
魚をスプーンでペトリ皿の上に置き、ピンセットで保持します。解剖ハサミで魚を斬首する。目の表面に傷をつけないでください。
0.1 Mリン酸ナトリウムを含むサンプル管に組織を入れます。そして、溶液中に血液が残らないように、きれいな緩衝液ですすいでください。組織を0.1 Mリン酸ナトリウム中の2.5%グルタルアルデヒドで4 Cで24時間固定し、固定溶液を除去し、0.1 Mリン酸ナトリウムでサンプルを数回すすいでください。
解剖プレート上の0.1 Mリン酸ナトリウムの滴の上に置くことによってサンプルを解剖する。細かい解剖はさみでヘッドサンプルを2つに切ります。あるいは、細かいピンセットの先端を目の側面から眼窩に慎重に入れて、目を集めてください。
次に、ソケットから目を引き出し、余分な組織を取り除きます。解剖した試料を0.1 Mリン酸ナトリウムを含むチューブに移す。サンプル処理中に目の上部に付着する可能性があるため、サンプルチューブに余分な組織がないことを確認してください。
タブ付きのマウントをホルダーの上に置きます。そして、ホルダーを解剖顕微鏡の基部とする。組織サンプルを細かいピンセットでマウントの上にそっと置き、角膜を上向きにします。
適切な装置を用いて試料を白金でコーティングする。試料を撮像するまで室温で保存した。所望の倍率の画像を取得する。
また、分析には2000〜2500倍の画像を使用します。明るさとコントラストを調整して、すべてのセルの境界線とマイクロリッジをはっきりと確認します。また、画像内の露出過多の領域は避けてください。
フィジー ImageJ 1.53 で TIFF イメージを開きます。スケールバーを使用してスケールを設定します。線ツールでスケールバーに等しい線を作成します。
[分析] を選択します。次に、スケールを設定します。そして、既知の距離で入力します。
次に、[分析]、[ツール]メニューを使用してROIマネージャを開きます。セルのサイズと真円度については、[解析]、[測定値の設定]、[形状記述子] の順に選択します。拡大鏡ツールを使用して、拡大鏡の下で細胞を確認します。
ポリゴンツールでセルを選択し、各選択範囲をROIマネージャに追加します。最後に、選択したセルを測定し、測定値を保存します。マイクロリッジ解析を続行するには、[画像]、[タイプ]メニューをクリックして、画像が8ビット形式であることを確認します。
次に、ポリゴンツールでセルを選択します。そして、[編集]をクリックして背景をクリアし、[外側をクリア]をクリックします。プロセスを選択、スムーズを選択して、画像を 1 ~ 3 回滑らかにします。
また、画像、調整、明るさ/コントラストから明るさとコントラストを調整して、マイクロリッジができるだけはっきりと目立つようにします。プロセス、フィルター、畳み込みをクリックして画像を畳み込みます。そして、プロセス、バイナリ、バイナリの作成をクリックしてバイナリに変換します。
次に、プロセス、バイナリ、スケルトン化を選択して白黒画像をスケルトン化します。分析されたスケルトン機能を使用して、マイクロリッジパラメータを測定し、値を保存します。創傷領域は、創傷後3時間で閉鎖される。
しかし、創傷の境界が結合されている部位は目に見えるままである。結果は、擦過した角膜上皮マイクロリッジ上に、創傷部位の隣にあるいくつかの細長い細胞において観察され得ることを示した。いくつかの周辺領域では、マイクロリッジは細胞の中心から失われる。
2つの末梢領域間の比較により、より短い平均マイクロリッジを有する細長い細胞を示し、創傷に対する反応としての細胞再構成を示す。これらの結果は、細胞形状の変化がマイクロリッジ修飾と相関し、創傷応答における角膜上皮内の不均一性を強調することを示唆している。手術には、均質で再現性のある創傷を行うための訓練が必要であることを忘れないでください。
電子顕微鏡法に加えて、組織は、組織学、免疫学的染色およびin situハイブリダイゼーションに使用することができる。これらは、創傷治癒中の細胞および分子変化におけるさらなる洞察を提供するであろう。ゼブラフィッシュを使うことで、角膜生物学の知識が広がります。
さらに、このモデルは薬理学的研究に優れており、目の進化についてもっと理解するために使用することができます。
