私の研究室では、目と脳がどのように一緒に成長するかを理解することに興味があります。この技術により、網膜入力が脳の成長と発達にどのように影響するかを研究することができます。生きている幼虫のゼブラフィッシュから片目を外科的に除去し、続いて視蓋骨を観察することで、同じ動物内および動物間で神経支配された蓋葉と脱神経化された蓋葉を比較することができます。
この技術を現代の分子アプローチと組み合わせることで、神経の発達、再生、変性の根底にあるメカニズムに関する新しい洞察を得ることができます。まず、カソード線とアノード線を電源に接続します。陰極線の端にあるワニ歯クリップを部分的にまっすぐにしたクリップに取り付け、ペーパークリップを水酸化カリウム溶液に挿入して瓶の側面に取り付けます。
陽極ワイヤーのアリゲータークリップをニードルホルダーの首に取り付けます。電源を約20ボルトに回し、タングステン線を水酸化カリウム溶液に浸し、ワイヤを溶液から斜めに引き出して、ワイヤを電気的に鋭くして微細な先端にします。解剖顕微鏡の下で針の先端をチェックして、十分に鋭いことを確認します。
曲線の針先は、鋭利な針をペトリ皿にそっと触れて曲げたときに生じます。手術当日、広口径ガラス牧草地ピペットを使用して、10〜15匹の幼虫を新鮮なE3で満たされた35ミリメートルのペトリ皿に移します。幼虫に麻酔薬を3〜5滴加える。幼虫が適切に麻酔されているかどうかを判断するには、タッチ応答の欠如を探します。
幼虫が3分後にまだ接触に反応し、再評価する場合は、麻酔薬をさらに2〜3滴加える。手術のために幼虫を固定化するには、少量のE3だけで1匹の幼虫を狭穴ガラス牧草地ピペットに入れます。次に、約200マイクロリットルの溶融した1%低融点またはLMPアガロースを幼虫を含むピペットに取り込み、幼虫がLMPアガロースに懸濁していることを確認するために混合する。解剖顕微鏡の下で35ミリメートルのペトリ皿の蓋を上向きに置き、幼虫とアガロースを逆さまのペトリ皿の蓋の上に噴き出します。
幼虫が滴の中心になるようにアガロースを広げる。鈍いタングステン針を使用して、片目が上を向いて横になるように幼虫を素早く、しかし静かに操縦する。アガロースがセットされるまで数分待ちます。
眼窩の端に続いて、細い電解的に研いだタングステン針の先端を使用して、目の周りの皮膚を突き刺します。次に、眼の側頭腹側から眼の下の針の縁をスライドさせる。制御された圧力を使用して、ソケットから目を離します。
針の側面で眼を背側および前方に押し続け、最終的に視神経を切り裂いて眼を解放する。あるいは、非常に細かい外科用鉗子を使用して、視神経をつまみ、目を内側から側方に押し込むことによって、目を取り除くこともできます。脱眼が成功したら、MMR溶液でアガロースを覆い、鉗子でペトリ皿のふたを安定させながら、タングステン針を頭の周りに、次に体の周りに優しくブラッシングすることによって、各幼虫をアガロースから解放する。
手術後、翌日まで抗生物質を添加したMMR溶液に幼虫を入れ、その後、幼虫をE3に戻し、実験の終点までそれらを飼育する。幼虫を末期麻酔した後、4%パラホルムアルデヒドで固定する。解剖顕微鏡下でシールガードプレート上のPBS液滴中に固定幼虫を懸濁させる。
AGM領域を覆う色素沈着領域の後方に1本のピンを配置し、もう1本のピンを卵黄伸長の端に沿って、脊索を通して2本のタングステンピンを配置して、それらを横方向に固定する。鋭いタングステン針と細かい鉗子で目を取り除きます。時には、顎を通って反対側に針を突いて、もう一方の目を取り除くことが可能です。
タングステン針を使用して、耳の側頭から腹側に傷をつけます。動いているのと同じ動作で、針を顎に後部持ってきて、耳と顎が取り除かれるまで静かに前方に引っ張ります。もう片方の目と耳は、針を顎に突き刺して取り除きます。
鉗子を使用して腹側器官と残りの卵黄を引き出します。最後に、後脳と脊髄の接合部付近の背側頭蓋皮膚に浅い切開を行う。鉗子で皮膚を持ち上げ、それを前方および間脳の周りに引っ張る。
鉗子で残りの組織を取り除きます。幼虫のピンを外し、PBSを1.5ミリリットルの微量遠心管に移す。真空グリースを入れた100ミリメートルのペトリ皿の蓋にチャンバー付きスライドを固定します。
免疫染色および処理された幼虫をウェルプレートまたは窪みスライドに移し、解剖顕微鏡でそれらを見る。幼虫を1%LMPアガロースカラムのチャンバー付きスライドに取り付けます。ピペットの向こうのガラスを使用して、チャンバー付きスライドに1匹の幼虫を置き、PBSをできるだけ少なくします。
同じピペットを使用して、溶けて温かい1%LMPアガロースで幼虫を覆います。LMPアガロースをカラムにピペットで刺し、背側表面が見えるようにできるだけ対称的に幼虫を配置します。眼球除去後、網膜軸索の進行性変性が視蓋ニューロピルにおいて観察された。
術後2日までに、RFP標識軸索は、ブラビングおよび断片化などの急速なウォラー変性の特徴を示した。RFP陽性穿刺は、矢印で示すように、テクタムの右側のニューロピルの内側と外側の両方で認められた。術後4日までに、断片化された軸索およびRFP標識された軸索破片が右胸骨でかなり減少し、死にかけている軸索および退化する軸索の比較的迅速なクリアランスが示された。
脳は、皮膚および結合組織の目、顎、耳、および頭蓋骨を解剖することによって露出した。理想的には、この手順の間、脳は無傷のままである。しかし、前脳の一部、特に嗅球は、皮膚または顎の頭蓋骨キャップを取り外したときに損傷を受けたか、完全に除去された可能性が高い。
さらに、皮膚を突き刺したりつまんだりして脳から引き離すと、テクタムの横の棚がスライスされることがあります。同一のサンプルは 2 つとありません。したがって、必要に応じて、目の除去と脳の解剖を通じて微妙な適応を行うことができる必要があります。
患者と鋭いツールは成功に不可欠です。この技術は、in vivo生細胞イメージングやRNAシーケンシングなどの細胞および分子アプローチでフォローアップし、光学テクタムの成長および発達の分子および細胞メカニズムに関する新しい洞察を得ることができます。
