感覚連想学習パラダイムは、小脳の機能、脳の他の部分との関係、および行動について多くのことを明らかにしました。マウスをモデル生物として用い、世界中の研究室がこれらの強力な方法を効果的かつ安価に実施するための十分な詳細の方法を提示する。私たちのプロトコルは、研究者が複数の小脳依存行動を設定することを可能にします。
当社の研究プラットフォームのコア機能は、特定の研究課題に合わせて簡単に変更できます。まず、カメラのシリアルインターフェイスケーブルをカメラとSBCのカメラポートに接続します。次に、SBCのオペレーティングシステムをホストコンピューターにダウンロードし、microSDカードにsshというファイルを作成します。
microSDカードをホストマシンから取り出します。SBC microSD カードスロットに挿入し、SBC に電力を供給します。次に、ホストへの有線接続を受け入れるように SBC を準備するには、端末を開き、コマンド ifconfig" と入力して、SBC のイーサネット IP アドレスを記録します。
次に、ラズベリーパイ構成設定の[インターフェイス]タブに移動し、カメラ、SSH、およびVNCのオプションを有効にします。有線接続を確立するには、イーサネットケーブルをSBCとホストコンピューターのイーサネットポートに接続し、これらのケーブルのもう一方の端をイーサネットスイッチに接続します。次に、VNC などの仮想ネットワークコンピューティングクライアントを使用して、SBC IP アドレスと既定の認証を使用してデスクトップにアクセスします。
次に、必要なソフトウェアと必要な Python ライブラリを SBC にダウンロードします。マイクロコントローラを直接制御するには、マイクロコントローラ統合開発環境またはIDEソフトウェアをダウンロードしてください。次に、SBC 端末ウィンドウを開き、「ダウンロード」ディレクトリに移動して、IDE をインストールします。
マイクロコントローラIDEを開いた後、「ツール」を選択し、「ライブラリの管理」を選択して、Paul Stoffregenのエンコーダライブラリをインストールします。最後に、SBC の USB ポートにサム ドライブを挿入し、USB 外部記憶装置をマウントするためのコマンドを入力します。SBCをマイクロコントローラのプログラミングポートに接続したら、マイクロコントローラIDEでダウンロードスケッチを開き、マイクロコントローラにアップロードします。
次に、適切なバージョンのArduinoアンドロイドをホストコンピュータにダウンロードしてインストールします。次に、DTSC_USをダウンロードします。ホストコンピュータにスケッチしません。
USB A-USB Bワイヤをホストコンピュータとマイクロコントローラに接続します。スケッチを開き、マイクロコントローラにアップロードします。マイクロコントローラのブレッドボード、LED、ロータリーエンコーダ、ドライバ付きステッピングモータ、ドライバ付きソレノイドバルブにワイヤを取り付けます。
次に、電源の1チャンネルをステッピングモータドライバの正VピンとGNDピンに配線します。電源装置の電源を入れた後、接続されているチャネル電圧を 25 ボルトに設定します。次に、電源の正リード線を電磁弁ドライバホールド電圧ピンに配線し、もう一方の正リード線をスパイク電圧ピンに配線します。
電源をオンにした後、スパイク電圧に接続されたチャネルを12ボルトに設定し、ホールド電圧に接続されたチャネルを2.5ボルトに設定します。次に、1平方インチあたり20ポンドの圧力に調整された空気源をソレノイドバルブに接続します。次に、ランニングホイールを作るには、フォームローラーから3インチのホイールを切り取り、正確なホイール中央に4分の1インチの穴を開けます。
次に、ホイールに4分の1インチのシャフトを挿入し、クランプハブを使用して所定の位置に固定します。ロータリーエンコーダを4.5インチのアルミチャンネルに貼り付けます。次に、アルミニウムブレッドボード上のアルミニウムチャネルを安定させます。
ホイールをロータリーエンコーダに取り付けた後、直角エンドクランプに挿入されたベアリングでホイールシャフトの自由側を安定させ、ブレッドボードに取り付けられた光学ポストに取り付けます。次に、光学ポストと直角ポストクランプを使用してヘッドレストを配置します。次に、条件刺激LEDとDEC無条件刺激の電磁弁出口を組み立てられたホイールの周囲に配置します。
次に、DTSC無条件刺激とPiカメラに使用されるステッピングモータを光学ポストに取り付けます。赤外光アレイをPiカメラと同じ側、動物の顔が配置される場所の少し上と真上に配置します。アクリル片の端に泡をテーピングすることによって、遅延触覚驚愕条件付けのための触覚刺激を作ります。
クランプハブを使用して4分の1インチのシャフトに取り付け、触覚刺激をステッピングモーターシャフトに取り付けます。ヘッドプレートを移植するには、マウスを麻酔し、頭皮の正中線に沿ってメスで、目の後ろ端から頭蓋骨まで切開する。切開部を広げ、両側を止血剤でクランプして開いたままにします。
シアノアクリレート接着剤を使用して、ヘッドプレートを頭蓋骨に取り付けます。次に、歯科用セメント粉末、溶剤、および触媒の混合物を露出した骨のすべての領域に塗布する。ヘッドプレートの後ろと前に閉じた皮膚を縫合する。
その後、術後鎮痛剤を注射し、マウスが少なくとも5日間回復できるようにします。行動セッションのためにマウスを準備するには、マウスをヘッドレストに取り付けてプラットフォームに慣れさせる。セッションの前に、電磁弁出口がターゲットの目の中央にあり、1 cm 未満の位置にあり、触覚刺激がマウスの鼻の中央にあり、約 1.5 cm 離れていることを確認してください。
DTSC セッションの準備を行うには、SBC 端末から GUI を起動します。3 回の試行のテスト・セッションを実行し、端末に印刷されるログに記録されたデータが 20 ステップより大きく 100 ステップ未満のたわみを示していることを確認します。セッションを実行するには、ヘッドレストにマウスをマウントし、SBC 端末から GUI を起動します。
カメラ録画を保存するには、セッションを開始する前に[ストリーム]ボタンをクリックします。動物の識別情報を動物IDフィールドに入力し、設定ボタンを押します。次に、目的の実験パラメータを入力し、[Arduinoにアップロード]ボタンをクリックします。
最後に、[セッションの開始]をクリックしてセッションを開始します。許容可能な照明を使用した録画セッションからのDECトレーニング結果がここに表示されます。許容可能な照明条件は、眼と眼周囲毛皮との間の良好なコントラストをもたらした。
8つのセッションで訓練された1匹のマウスのパフォーマンスは、訓練されていないマウスでは条件付けされた応答がなく、マウスが訓練されると堅牢な条件付け応答を伴う行動痕跡を示した。サンプルのトライアルビデオでは、訓練されたマウスがLEDの条件刺激に応答して目を閉じるのに成功し、訓練されていないマウスは無条件刺激まで点滅しません。条件付けされた応答は、数日間にわたって実行される行動セッションを通じて、サイズと頻度が増加します。
最適でない照明条件は、集録されるデータの品質を著しく制限します。目と周囲の毛皮とのコントラストが低い場合、画像のわずかな変化は、1回のセッションで無条件応答の記録された形状を大きく変化させ、まぶたの位置を検出するための信号対雑音比を低下させる可能性がある。ここでは、5 つのセッションでトレーニングを受けたマウスの DTSC トレーニング結果を示します。
サンプルのトライアルビデオでは、訓練されたマウスがLEDの条件付き刺激に応答してホイールを正常にバックアップし、訓練されていないマウスは触覚無条件刺激が適用されるまでホイールを動かさないことを示しています。条件付けされた応答の頻度と振幅は、トレーニングが進むにつれて増加します。低振幅の無条件応答を生成する無条件刺激で訓練された動物のコホートでは、4日間の訓練後に一貫して条件付け応答を生成することを学んだ動物はいなかった。
行動を成功させるためには、リグの上を走っているときの動物の快適さが重要です。動物をリグに慣れさせる前に、ホイールが自由かつ均等に回転することを確認することが重要です。この柔軟なプラットフォームを使用して、頭部固定動物での学習中に、小脳の出力細胞であるプルキンエニューロンの活動を画像化し、摂動させることに成功しました。
