単一のスペックルイメージングとトラクションフォース顕微鏡のカップリング解析により、成長コーンの前進とナビゲーションのための分子機械を解析できます。技術としては、市販の材料および標準的な顕微鏡を使用する。研究者は文字通り彼らの研究の技術に適応することができます。
インビトロ3の日に培養培地中の1〜2000の希釈でテトラメチルローダミンまたはTMRリガンドでニューロンを治療することから始めます。その後、ニューロンを摂氏37度で5%の二酸化炭素で1時間維持します。インキュベーション後、事前に温めたPBSでTMRリガンドを3回洗浄します。
0.5ミリリットルの加温ライボヴィッツのL-15培地をニューロンに加えてPBSを取り除く。ニューロンを摂氏37度で1時間維持します。次に、蛍光顕微鏡をオンにし、状態トップインキュベーターを摂氏37度に設定します。
その後、TMRリガンド処理されたニューロンを温めたステージトップインキュベーターのガラス底皿に入れます。Lifeact および HaloTag アクチン蛍光チャネルの場合は 500 ミリ秒の露出時間、ビニングは、50 フレームの 3 秒の時間間隔でピクセルあたり 0.065 ミクロン、0.065 ミクロンとして設定します。ライフアクトを強く発現する成長コーンを選択した後、毎週ハロタグアクチンを表現する。
ダイヤフラムのフィールドを閉じて、成長コーンを含む最小領域を照らし、タイムラプス画像を取得します。当日のvitro 3では、培養培地を0.5ミリリットルの加温されたライボヴィッツのL-15培地に置き換え、ニューロンを摂氏37度で1時間維持します。トラクションフォース顕微鏡の場合は、レーザースキャン共焦点顕微鏡をオンにし、ステージトップインキュベーターを摂氏37度に設定します。
事前に警告されたステージトップインキュベーターのガラス底皿にニューロンを置きます。メニュースクリプトに記載されているように画像取得パラメータを設定し、強化された緑色蛍光タンパク質またはEGFPを強く発現する成長コーンを選択します。ゲル表面に焦点を合わせ、タイムラプス画像を取得します。
完了すると、画像処理ソフトウェアを使用して、単一チャネルタイムラプスRGB画像スタックを生成します。その後、TIFFファイルとして画像を保存します。次に、100マイクロリットルの100マイクロリットルを体積で10%重量のドデシル硫酸ナトリウムまたはSDSを蒸留水に溶解させてガラス底皿に塗布し、基質からニューロンを放出してゲル基板を弛緩させた。
その後、温度を安定させるために摂氏37度で5分間、ステージトップインキュベーターで皿をインキュベートします。レーザー走査共焦点顕微鏡では、ゲル表面に焦点を合わせ、訓練されていない基板内のビーズの画像を取得します。訓練されていない基板内のビーズの単一チャネルRGB画像を生成し、tiffファイルとして保存します。
トラクションフォース解析コードTFM2021をダウンロードし、MATLABでTFM2021を開きます。メインを開きます。m を TFM2021 で実行します。
グラフィカル ユーザー インターフェイスが画面に表示される場合。訓練されていない負荷をクリックし、基板画像を、訓練されていない基板内のX-Y位置補正ビード画像を選択します。蛍光ビーズ画像をロードし、イメージビーズのタイムラプススタックを選択します。
次に、明視野画像をロードして明視野のタイムラプススタック画像を選択し、GFP画像のロードを使用してEGFPのタイムラプススタック画像を選択します。グラフィカル ユーザー インターフェイスのドロップダウン リストから、[ROI] をクリックする前に GFP を選択し、表示されるセル イメージ上の 2 つのポイントをクリックして、拡大円錐を含む対象の四角形領域を指定します。完了したら、グラフィカルユーザーインターフェイス上の保存ボタンをクリックして、選択したスタックイメージをROIと一緒にマットファイルに保存します。
次に、スポット検出をクリックし、ダイアログボックスに必要な値を入力して、ビード検出のしきい値を決定します。計算を開始するために大丈夫ヒット。計算が終了したら、プロットトラックをクリックして、先ほど選択した領域を拡大し、検出されたビーズを白い点として表示します。
成長円錐の下に正しいドットを含むポリゴン領域を区切るために選択ビードを使用します。キーボードの Enter キーを押すと、ポリゴン領域内の白い点が赤に変わります。グラフィカルユーザーインターフェースで推定力をクリックします。
次に、原稿で説明されているように、ピクセルサイズとヤング率の値を入力します。ポアソン比の値を0.3とし、推定力を実行して計算を開始します。ソフトウェアは、計算結果をスプレッドシート形式のファイルに保存します。
ニューロン成長コーンの蛍光画像は、完全に開いた狭い横隔膜下で成長コーン形態の視覚化を可能にする高いLifeact発現を示した。ハロタグアクチン発現レベルは、薄暗い信号で非常に低かった。横隔膜が適切に狭くなると、バックグラウンド信号が減少し、斑点の単一の行為が成長コーンに現れる。
すべてのステップを適切に達成した研究者は、成長コーンにおけるF-アクチン逆行流を観察する。ポリアクリルアミドゲルの剛性は、微小球の重量に起因するインデントの深さを計算することによって求めた。レーザー走査共焦点顕微鏡を用いて、ゲル表面と微小球の底部の画像を撮影した。
蛍光ビーズからのシグナルは、インデントされた領域のゲル表面では見えませんでした。ポリアクリルアミドゲルおよび神経成長コーンに埋め込まれたビーズの蛍光画像は、その起源および変位位置におけるビーズを示した。成長コーンのEGFPシグナルも観察された。
キモグラフは、ビードの動きを基準ビーズと比較して表示した。単一のスペックルイメージングを行う場合、毎週ニューロンを選択する重要なことは、最小2つの領域の下で行動する方法を表す。牽引力顕微鏡を行う場合、高倍率イメージングは、正確な牽引力の集中のために重要である。
