A análise de acoplamento de imagens de partículas simples e força de tração microscópica pode analisar máquinas moleculares para avanço de cone de crescimento e navegação. Como as técnicas usam materiais disponíveis comercialmente e microscópios padrão. Os pesquisadores podem literalmente adaptar-se às técnicas em seus estudos.
Comece tratando os neurônios com tetrametil-rhodamina ou ligante TMR a uma diluição de um a 2000 em meio de cultura no dia in vitro 3. Em seguida, mantenha os neurônios a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por uma hora. Após a incubação, lave o ligante TMR três vezes com PBS pré-aquecido.
Remova o PBS antes de adicionar 0,5 mililitros do meio L-15 de Leibovitz aquecido nos neurônios. Mantenha os neurônios a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, ligue um microscópio de epifluorescência e coloque a incubadora superior do estado em 37 graus Celsius.
Em seguida, coloque os neurônios tratados tmr na placa de fundo de vidro na incubadora superior do palco aquecido. Defina os parâmetros de aquisição de imagem, como tempo de exposição em 500 milissegundos para um lifeact e canais de fluorescência de ato de HaloTag e binning como 0,065 míclico por 0,065 mígdo por pixel no intervalo de tempo de três segundos para 50 quadros. Depois de selecionar um cone de crescimento que expressa fortemente lifeact e expressa semanalmente HaloTag-actin.
Feche o campo no diafragma para iluminar uma área mínima que inclua o cone de crescimento e adquira imagens de lapso de tempo. No dia in vitro 3, substitua o meio de cultura por 0,5 mililitros de meio L-15 de Leibovitz aquecido e mantenha os neurônios por uma hora a 37 graus Celsius. Para microscopia de força de tração, ligue um microscópio confocal de varredura a laser e coloque a incubadora superior do palco em 37 graus Celsius.
Coloque os neurônios na placa de fundo de vidro na incubadora superior do palco pré-avisada. Defina os parâmetros de aquisição de imagem conforme descrito no script do menu e selecione um cone de crescimento que expresse fortemente proteína de fluorescência verde aprimorada ou EGFP. Concentre-se na superfície do gel e adquira imagens de lapso de tempo.
Quando feito, use um software de processamento de imagem para produzir pilhas de imagens RGB de lapso de tempo de um único canal. Em seguida, salve as imagens como arquivos de tiff. Em seguida, aplique 100 microliters de 10% de peso em volume sulfato de dodecyl de sódio ou SDS dissolvido em água destilada ao prato inferior de vidro para relaxar o substrato de gel liberando neurônios do substrato.
Em seguida, incubar o prato na incubadora superior do palco por cinco minutos a 37 graus Celsius para estabilizar a temperatura. No microscópio confocal de varredura a laser, concentre-se na superfície do gel para adquirir uma imagem das contas no substrato não treinado. Produza uma imagem RGB de um único canal das contas no substrato não treinado e salve esta imagem como um arquivo de tiff.
Baixe o código de análise de força de tração TFM2021 e abra o TFM2021 no MATLAB. Aberto principal. m em TFM2021 e executá-lo.
Quando uma interface gráfica do usuário aparece na tela. Clique na imagem de carga não treinada, substrato e selecione a imagem de contas corrigida da posição X-Y no substrato não treinado. Vá carregar imagens fluorescentes e selecione a pilha de contas de lapso de tempo de contas de imagem.
Em seguida, clique em carregar imagens de campo brilhante para escolher a imagem de pilha de lapso de tempo do campo brilhante e usar imagens de GFP de carga para selecionar a imagem de pilha de lapso de tempo do EGFP. A partir da lista suspensa na interface gráfica do usuário, selecione GFP antes de clicar no ROI para especificar a região de interesse do retângulo, incluindo o cone de crescimento, clicando em dois pontos na imagem da célula exibida. Uma vez feito clique no botão salvar na interface gráfica do usuário para salvar as imagens selecionadas em pilha junto com o ROI em um arquivo de tapete.
Em seguida, clique no local detectar e inserir um valor desejado na caixa de diálogo para determinar um limiar para detecção de contas. Bata bem para começar o cálculo. Após terminar o cálculo, clique na faixa de plot para ampliar a região selecionada anteriormente e exibir as contas detectadas como pontos brancos.
Use contas selecionadas para demarcar uma região poligonal que inclua os pontos corretos sob o cone de crescimento. Em seguida, pressionando enter no teclado, os pontos brancos dentro da região poligonal se transformarão em vermelho. Clique na força de estimativa na interface gráfica do usuário.
Em seguida, valores de entrada para o tamanho do pixel e módulo de Young como explicado no manuscrito. Coloque o valor da razão de Poisson como 0,3 e execute a força de estimativa para iniciar o cálculo. O software salvará os resultados de cálculo em um arquivo de formato de planilha.
As imagens de fluorescência de um cone de crescimento neuronal mostraram uma expressão de vida alta permitindo a visualização da morfologia do cone de crescimento sob um diafragma totalmente aberto e estreito. Os níveis de expressão halotag-actin eram muito baixos com sinais fracos. Quando o diafragma é um apropriadamente estreito, os sinais de fundo diminuem e ato único em manchas aparecem no cone de crescimento.
Pesquisadores que apropriadamente alcançarem todas as etapas observarão f-actin fluxo retrógrado no cone de crescimento. A rigidez do gel de poliacrilamida foi determinada pelo cálculo da profundidade do recuo causado devido ao peso da microesfera. Um microscópio confocal de varredura a laser foi usado para capturar imagens da superfície do gel e da parte inferior da microesfera.
Os sinais das contas fluorescentes não eram visíveis na superfície do gel na região recuada. Imagens de fluorescência das contas embutidas no gel de poliacrilamida e no cone de crescimento neural, mostraram as contas em sua origem e posições deslocadas. Também foi observado o sinal EGFP do cone de crescimento.
Os kymographs exibiram os movimentos da conta em comparação com uma conta de referência. Ao realizar uma única imagem de manchas, coisas importantes para selecionar um neurônio que semanalmente expressa como agir sob duas uma área mínima. Ao realizar uma microscopia de força de tração, a alta imagem de ampliação é importante para uma concentração precisa da força de tração.
