Die Kopplungsanalyse von Einzelfleckenbildgebung und Zugkraftmikroskopie kann molekulare Maschinen für wachstumskegelvordringend und -navigation analysieren. Da die Techniken handelsübliche Materialien und Standardmikroskope verwenden. Forscher können sich buchstäblich an die Techniken in ihren Studien anpassen.
Beginnen Sie mit der Behandlung der Neuronen mit Tetramethyl-Rhodamin oder TMR-Liganden bei einer Verdünnung von eins bis 2000 in Kulturmedium am Tag in vitro 3. Dann halten Sie die Neuronen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für eine Stunde. Nach der Inkubation den TMR-Liganden dreimal mit vorgewärmtem PBS waschen.
Entfernen Sie das PBS, bevor Sie 0,5 Milliliter erwärmtes Leibovitz-L-15-Medium in die Neuronen geben. Halten Sie die Neuronen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Schalten Sie als Nächstes ein Epifluoreszenzmikroskop ein und stellen Sie den Staatlichen Top-Inkubator auf 37 Grad Celsius ein.
Legen Sie dann die mit TMR-Liganden behandelten Neuronen in die Glasbodenschale auf den oberen Inkubator der erwärmten Stufe. Stellen Sie die Bildaufnahmeparameter wie Belichtungszeit auf 500 Millisekunden für Lifeact- und HaloTag-Aktin-Fluoreszenzkanäle und Binning auf 0,065 Mikrometer x 0,065 Mikrometer pro Pixel im Zeitintervall von drei Sekunden für 50 Bilder ein. Nach der Auswahl eines Wachstumskegels, der Lifeact stark exprimiert und wöchentlich HaloTag-Aktin exprimiert.
Schließen Sie das Feld auf der Membran, um eine minimale Fläche zu beleuchten, die den Wachstumskegel enthält, und erfassen Sie Zeitrafferbilder. Ersetzen Sie am Tag in vitro 3 das Kulturmedium durch 0,5 Milliliter erwärmtes Leibovitz-L-15-Medium und halten Sie die Neuronen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Schalten Sie für die Zugkraftmikroskopie ein konfokales Laserscanning-Mikroskop ein und stellen Sie den oberen Inkubator der Bühne auf 37 Grad Celsius.
Legen Sie die Neuronen auf die Glasbodenschale auf den vorgewarnten oberen Inkubator der Bühne. Stellen Sie die Bildaufnahmeparameter wie im Menüskript beschrieben ein und wählen Sie einen Wachstumskegel aus, der ein verstärktes grünes Fluoreszenzprotein oder EGFP stark exprimiert. Konzentrieren Sie sich auf die Geloberfläche und nehmen Sie Zeitrafferbilder auf.
Wenn Sie fertig sind, verwenden Sie eine Bildverarbeitungssoftware, um Einkanal-Zeitraffer-RGB-Bildstapel zu erstellen. Speichern Sie dann die Bilder als TIFF-Dateien. Als nächstes tragen Sie 100 Mikroliter natriumdodecylsulfat oder SDS, gelöst in destilliertem Wasser, auf die Glasbodenschale auf, um das Gelsubstrat zu entspannen, indem Neuronen aus dem Substrat freigesetzt werden.
Dann inkubieren Sie die Schüssel im Stage Top Inkubator für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius, um die Temperatur zu stabilisieren. Konzentrieren Sie sich im konfokalen Laserscanning-Mikroskop auf die Geloberfläche, um ein Bild der Kügelchen im ungespannten Substrat aufzunehmen. Erzeugen Sie ein einkanaliges RGB-Bild der Perlen im ungespannten Substrat und speichern Sie dieses Bild als TIFF-Datei.
Laden Sie den Zugkraftanalysecode TFM2021 herunter und öffnen Sie TFM2021 in MATLAB. Öffnen Sie die Hauptzeile. m in TFM2021 und führen Sie es aus.
Wenn eine grafische Benutzeroberfläche auf dem Bildschirm angezeigt wird. Klicken Sie auf Untrainiertes Substratbild laden und wählen Sie das X-Y-positionskorrigierte Perlenbild im ungespannten Substrat aus. Gehen Sie zu fluoreszierende Perlenbilder laden und wählen Sie den Zeitrafferstapel der Bildperlen aus.
Klicken Sie dann auf Hellfeldbilder laden, um das Zeitraffer-Stack-Bild von Bright-Field auszuwählen, und verwenden Sie Load GFP-Bilder, um das Zeitraffer-Stack-Bild von EGFP auszuwählen. Wählen Sie in der Dropdown-Liste auf der grafischen Benutzeroberfläche GFP aus, bevor Sie auf ROI klicken, um den gewünschten Rechteckbereich einschließlich des Wachstumskegels anzugeben, indem Sie auf zwei Punkte auf dem angezeigten Zellenbild klicken. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern auf der grafischen Benutzeroberfläche, um die ausgewählten Stack-Bilder zusammen mit dem ROI in einer mat-Datei zu speichern.
Klicken Sie anschließend auf Spot-Erkennung und geben Sie einen gewünschten Wert in das Dialogfeld ein, um einen Schwellenwert für die Perlenerkennung zu bestimmen. Klicken Sie auf OK, um die Berechnung zu starten. Klicken Sie nach Abschluss der Berechnung auf Plotspur, um den zuvor ausgewählten Bereich zu vergrößern und die erkannten Perlen als weiße Punkte anzuzeigen.
Verwenden Sie ausgewählte Perlen, um einen polygonalen Bereich abzugrenzen, der die richtigen Punkte unter dem Wachstumskegel enthält. Wenn Sie dann die Eingabetaste auf der Tastatur drücken, ändern sich die weißen Punkte innerhalb des polygonalen Bereichs in Rot. Klicken Sie in der grafischen Benutzeroberfläche auf Kraft schätzen.
Geben Sie dann Werte für die Pixelgröße und den Elastizitätsmodul ein, wie im Manuskript erläutert. Geben Sie den Wert für das Poisson-Verhältnis als 0,3 an und führen Sie die Schätzkraft aus, um die Berechnung zu starten. Die Software speichert die Berechnungsergebnisse in einer Datei im Tabellenkalkulationsformat.
Die Fluoreszenzbilder eines neuronalen Wachstumskegels zeigten eine hohe Lifeact-Expression, die die Visualisierung der Wachstumskegelmorphologie unter einem vollständig offenen und schmalen Zwerchfell ermöglicht. Die HaloTag-Aktin-Expressionsniveaus waren mit schwachen Signalen sehr niedrig. Wenn das Zwerchfell entsprechend verengt ist, verringern sich die Hintergrundsignale und ein einzelner Akt in Sprenkeln erscheint im Wachstumskegel.
Forscher, die alle Schritte entsprechend erreichen, werden den retrograden F-Aktin-Fluss im Wachstumskegel beobachten. Die Steifigkeit des Polyacrylamidgels wurde durch Berechnung der durch das Gewicht der Mikrosphäre verursachten Eindringtiefe bestimmt. Ein konfokales Laserscanning-Mikroskop wurde verwendet, um Bilder der Geloberfläche und des Bodens der Mikrosphäre aufzunehmen.
Die Signale der fluoreszierenden Kügelchen waren an der Geloberfläche im eingerückten Bereich nicht sichtbar. Fluoreszenzbilder der in das Polyacrylamid-Gel und den neuronalen Wachstumskegel eingebetteten Perlen zeigten die Perlen in ihrem Ursprung und ihren verschobenen Positionen. Das EGFP-Signal des Wachstumskegels wurde ebenfalls beobachtet.
Die Kymographen zeigten die Bewegungen der Perle im Vergleich zu einer Referenzperle an. Bei der Durchführung einer einzelnen Speckle-Bildgebung sind wichtige Dinge, um ein Neuron auszuwählen, das wöchentlich ausdrückt, wie man unter zwei einer minimalen Fläche aktiniert. Bei der Durchführung einer Zugkraftmikroskopie ist die Bildgebung mit hoher Vergrößerung wichtig für die genaue Konzentration der Zugkraft.
