L'analisi di accoppiamento di imaging a singola macchia e forza di trazione microscopica può analizzare macchinari molecolari per l'avanzamento e la navigazione del cono di crescita. Poiché le tecniche utilizzano materiali disponibili in commercio e microscopi standard. I ricercatori possono letteralmente adattarsi alle tecniche nei loro studi.
Iniziare trattando i neuroni con tetrametil-rodamina o ligando TMR ad una diluizione da uno a 2000 in terreno di coltura il giorno in vitro 3. Quindi mantenere i neuroni a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per un'ora. Dopo l'incubazione, lavare il ligando TMR tre volte con PBS preriscaldato.
Rimuovere il PBS prima di aggiungere 0,5 millilitri di mezzo L-15 di Leibovitz riscaldato nei neuroni. Mantenere i neuroni a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi, accendere un microscopio a epifluorescenza e impostare l'incubatore superiore dello stato a 37 gradi Celsius.
Quindi posizionare i neuroni trattati con ligando TMR nel piatto inferiore di vetro sull'incubatrice superiore del palco riscaldata. Impostare i parametri di acquisizione dell'immagine come il tempo di esposizione a 500 millisecondi per i canali di fluorescenza Lifeact e HaloTag-actina e il binning come 0,065 micron per 0,065 micron per pixel a un intervallo di tempo di tre secondi per 50 fotogrammi. Dopo aver selezionato un cono di crescita che esprime fortemente Lifeact e settimanalmente esprime HaloTag-actina.
Chiudere il campo sul diaframma per illuminare un'area minima che includa il cono di crescita e acquisire immagini time lapse. Il giorno in vitro 3, sostituire il terreno di coltura con 0,5 millilitri di mezzo L-15 di Leibovitz riscaldato e mantenere i neuroni per un'ora a 37 gradi Celsius. Per la microscopia con forza di trazione, accendere un microscopio confocale a scansione laser e impostare l'incubatore superiore del palcoscenico a 37 gradi Celsius.
Posiziona i neuroni sul piatto inferiore di vetro sull'incubatore superiore dello stadio pre-avvertito. Impostare i parametri di acquisizione dell'immagine come descritto nello script del menu e selezionare un cono di crescita che esprima fortemente la proteina di fluorescenza verde migliorata o EGFP. Concentrati sulla superficie del gel e acquisisci immagini time-lapse.
Al termine, utilizzare un software di elaborazione delle immagini per produrre stack di immagini RGB time-lapse a canale singolo. Quindi salvare le immagini come file tiff. Quindi, applicare 100 microlitri del 10% in peso in volume di sodio dodecil solfato o SDS disciolto in acqua distillata sul piatto di fondo di vetro per rilassare il substrato del gel rilasciando neuroni dal substrato.
Quindi incubare il piatto nell'incubatore superiore del palco per cinque minuti a 37 gradi Celsius per stabilizzare la temperatura. Nel microscopio confocale a scansione laser, concentrarsi sulla superficie del gel per acquisire un'immagine delle perline nel substrato non teso. Produrre un'immagine RGB a canale singolo delle perline nel substrato non teso e salvare questa immagine come file tiff.
Scarica il codice di analisi della forza di trazione TFM2021 e apri TFM2021 in MATLAB. Apri principale. m in TFM2021 ed eseguirlo.
Quando sullo schermo viene visualizzata un'interfaccia utente grafica. Fare clic su Carica immagine del substrato non addestrata e selezionare l'immagine del tallone corretta per la posizione X-Y nel substrato non teso. Vai a caricare immagini di perline fluorescenti e seleziona la pila time-lapse di perline di immagini.
Quindi fare clic su Carica immagini in campo luminoso per scegliere l'immagine dello stack time-lapse di bright-field e utilizzare carica immagini GFP per selezionare l'immagine dello stack time-lapse di EGFP. Dall'elenco a discesa nell'interfaccia utente grafica, selezionare GFP prima di fare clic su ROI per specificare la regione rettangolare di interesse, incluso il cono di crescita, facendo clic su due punti sull'immagine della cella visualizzata. Una volta fatto clicca sul pulsante salva sull'interfaccia utente grafica per salvare le immagini dello stack selezionato insieme al ROI in un file mat.
Quindi, fare clic su Spot Detect e inserire un valore desiderato nella finestra di dialogo per determinare una soglia per il rilevamento di perline. Premi ok per iniziare il calcolo. Dopo aver terminato il calcolo, fare clic su traccia di creazione per ingrandire la regione selezionata in precedenza e visualizzare le perline rilevate come punti bianchi.
Utilizzare perline selezionate per delimitare un'area poligonale che include i punti corretti sotto il cono di crescita. Quindi, premendo invio sulla tastiera, i punti bianchi all'interno della regione poligonale si trasformeranno in rosso. Fare clic su stima forza nell'interfaccia utente grafica.
Quindi inserisci i valori per la dimensione dei pixel e il modulo di Young come spiegato nel manoscritto. Metti il valore per il rapporto di Poisson come 0,3 ed esegui la forza di stima per avviare il calcolo. Il software salverà i risultati del calcolo in un file in formato foglio di calcolo.
Le immagini di fluorescenza di un cono di crescita neuronale hanno mostrato un'elevata espressione di Lifeact che consente la visualizzazione della morfologia del cono di crescita sotto un diaframma completamente aperto e stretto. I livelli di espressione di HaloTag-actina erano molto bassi con segnali deboli. Quando il diaframma è opportunamente ristretto, i segnali di fondo diminuiscono e il singolo atto nelle macchie appare nel cono di crescita.
I ricercatori che raggiungono in modo appropriato tutti i passaggi osserveranno il flusso retrogrado di F-actina nel cono di crescita. La rigidità del gel di poliacrilammide è stata determinata calcolando la profondità di rientranza causata dal peso della microsfera. Un microscopio confocale a scansione laser è stato utilizzato per catturare immagini della superficie del gel e del fondo della microsfera.
I segnali provenienti dalle perle fluorescenti non erano visibili sulla superficie del gel nella regione frastagliata. Le immagini di fluorescenza delle perline incorporate nel gel di poliacrilammide e nel cono di crescita neurale, hanno mostrato le perle nella loro origine e posizioni spostate. È stato osservato anche il segnale EGFP del cono di crescita.
I kymographs mostravano i movimenti del tallone rispetto a un tallone di riferimento. Quando si esegue un singolo speckle imaging, cose importanti per selezionare un neurone che settimanalmente esprime come actina sotto due un'area minima. Quando si esegue una microscopia con forza di trazione, l'imaging ad alto ingrandimento è importante per una concentrazione accurata della forza di trazione.
