これらのプロトコルは、さまざまな骨格要素にわたるダウンストリームDNA抽出で使用するための骨粉末生成のベストプラクティスガイドラインとして機能します。象牙質と錐体ピラミッド以外の場所について、いくつかの公開された古代DNAサンプリングプロトコルがあります。今日は、3つの選択肢の詳細なサンプリング方法を紹介します。
これらの方法は、劣化した法医学遺体での使用だけでなく、人間以外の標本で同様の技術を開発するためのベースラインとしても大きな可能性を示しています。すべてのサンプリングは、UV光を備えたPCRフードまたはバイオセーフティキャビネットの下にある専用のクリーンルームで実行します。空気の流れを止め、ベンチトップ全体に滅菌アルミホイルを広げて、浮遊骨粉や破片をキャッチします。
計量紙のシートを滅菌計量トレイに入れます。ハンドヘルドクランプを使用して、根元を計量トレイの上に下に向けて、エナメル質で除染された大臼歯を保持します。歯科用ドリルにダイヤモンドエッジの円形カッティングホイールを装備します。
ドリルを中速設定に設定した状態で、ドリルの端を約20度の角度で根元に軽く触れます。サンプルをトレイに下向きにこすり落とし、根元から黄色の最も外側の材料を収集します。象牙質の軽い材料が見えるようになったら、収集を停止します。
粉末を2ミリリットルのLoBindセーフロックチューブに移し、この収集された粉末の塊を密閉された天びんを使用して少なくとも0.01ミリグラムの精度で記録します。粉末を計量紙から2ミリリットルのLoBindセーフロックチューブに移して抽出します。このチューブは摂氏20度で保管してください。
すべての骨片とできるだけ多くの粉末を回収するようにしてください。各サンプリング間でホイルを交換し、使用済みのホイルをオートクレーブ可能なバイオハザードバッグに廃棄します。作業エリアを除染し、次の骨に移動する前に毎回ベンチトップ全体に滅菌アルミホイルを広げます。
計量用紙の小さなシートを標準の計量トレイに入れます。歯科用ドリルを使用して、上椎骨弓の皮質骨の最外層を除去して廃棄します。次に、椎骨をハンドクランプで固定し、棘突起を外側に、上側を下にして固定します。
椎骨を保持しながら、棘突起と低速および高トルクのラメラとの融合によって形成されたV字型のノッチの中心に上向きにドリルします。抵抗が著しく低下した場合は、掘削を中止してください。穴あけ位置を少し変えて、50〜100ミリグラムの骨粉が集まるまで繰り返します。
骨粉を計量紙から抽出用の2ミリリットルのLoBindチューブに移し、摂氏20度で保管します。ホイルを廃棄する前に、すべての骨片とできるだけ多くの粉末が回収されていることを確認してください。前述のように、作業領域を除染し、サンプル収集の準備をします。
計量用紙の小さなシートを標準の計量トレイに置きます。距骨ドームを上向きに保持し、内側の表面をコレクターに向かって、計量トレイの上に置きます。低速および高トルクに設定されたローゲージビットを備えた歯科用ドリルを使用して、距骨の首から約1ミリメートルの深さまで皮質骨をこすります。
穴あけ位置を変更し、約50〜100ミリグラムの骨粉が収集されるまでこれを繰り返します。この骨粉を計量紙から2ミリリットルのLoBindチューブに移して抽出します。粉末は摂氏20度で無期限に保管してください。
残りの骨と余分な粉末は、摂氏25度の乾燥した温度制御された無菌環境に保管してください。すべての廃棄物は、オートクレーブのバイオハザードバッグまたはレセプタクルに入れて処分してください。すべての再利用可能な機器を滅菌または除染し、各サンプリングの間にUVにさらします。
Pars petrosaは、調査された他の23の解剖学的サンプリング場所よりも高い内因性DNAを生成しました。このプロトコルで提示された7つの追加の解剖学的サンプリング場所は、次に高い収量を生み出しました。代替の場所は、標準的な集団遺伝学分析に十分なDNA収量を一貫して生成しました。
すべての解剖学的サンプリング場所に由来するライブラリの複製率は低く、複雑さが高いことを示しています。歯と胸椎は十分な分子回復を示しました。骨サンプリングの最も困難な側面の1つは、ドリルの保持方法、掘削場所、掘削を停止するタイミングなどの穴あけプロセスです。
