アリザリンレッド染色を使用してゼブラフィッシュ幼虫の化学的に誘発された骨量減少を検出

この方法は、ゼブラフィッシュの化学物質によって誘発される骨毒性を検出するのに役立ちます。アリザリンレッド 固定組織の染色は、いくつかの標本の比較を容易にすることができる骨格変化の永久記録を生成します。この技術は、骨粗鬆症の特徴の1つが骨量の減少であるため、ゼブラフィッシュモデルで骨粗鬆症を研究するのに役立つ可能性があります。

受精後9日目に各グループから10匹のゼブラフィッシュ幼虫をランダムに取り除き、1ミリリットルの2%パラホルムアルデヒドと1X PBSに2時間固定します。溶液をデカントし、pH7.5または10ミリモルの塩化マグネシウムで100ミリモルのトリスHCLを使用してゼブラフィッシュの幼虫を洗浄します。脱染色のために、溶液をデカントし、原稿に記載されているように一連の溶液中で幼虫を5分間インキュベートする。

最終インキュベーション後、溶液をデカントし、3%過酸化水素と0.5%水酸化カリウムからなる溶液で漂白することによって色素を除去する。色素が完全に除去されるまで、10分に1回観察してください。ゼブラフィッシュの幼虫を25%グリセリン、0.1%水酸化カリウムで泡がなくなるまでそれぞれ10分間数回すすぎます。

1ミリリットルの0.01%アリザリンに浸して幼虫を染色する。溶液をデカントし、1ミリリットルの50%グリセリンまたは0.1%水酸化カリウムを加えてバックグラウンドをクリアします。その後の観察のために、魚を新鮮な50%グリセリンまたは0.1%水酸化カリウムに保管します。

一度に1匹ずつ幼虫をスライドガラスに移し、幼虫を液滴の中央に保ちます。実体顕微鏡で幼虫を観察する。カメラの電源を入れます。

ソフトウェアを開き、デフォルト設定のままにします。AEをクリックし、適切な露光時間を選択して最適な画像を取得します。同じ設定ですべての画像をキャプチャします。

後で分析できるように、画像をドットtiff形式で保存します。画像をダブルクリックしますJアイコン。保存された画像を分析するには、ファイルをクリックしてから開き、次に画像をクリックし、8ビットを入力して選択します。

編集をクリックし、反転します。分析をクリックし、キャリブレーションします。ポップアップ インターフェイスで [未キャリブレーション OD] を選択します。

下部インターフェイスの左下にあるグローバルキャリブレーションを確認し、[OK]をクリックします。分析をクリックし、スケールを設定してから、スケールを削除します。以下のグローバルを確認し、[OK]をクリックします。

[分析]をクリックし、測定値を設定します。ポップアップ インターフェイスでアイテム領域を選択します。以下のしきい値の制限を確認して、選択した範囲のみを測定し、[OK]をクリックします。

画像をクリックし、調整してからしきい値を表示し、ポップアップインターフェイスの中央にあるスライダーをスライドさせます。1 つのイメージでテストするすべてのターゲットが選択されるように、適切なしきい値を選択します。そして、[設定]をクリックします。

分析をクリックしてから、測定し、日付を保存します。アリザリンレッド染色は、ゼブラフィッシュ幼虫の骨石灰化の変化を測定するための高感度で特異的な方法です。受精後9日目に、傍蝶形骨、手術、角鰓、脊索などの頭骨格の多くの骨が石灰化しているため、赤く染まります。

対照的に、耳石のような非骨の構造は茶色の黒に見えます。総染色面積を定量化するために実施されたデジタル分析は、酢酸鉛処理群の1リットル当たり10および20ミリグラムについて染色面積の有意な減少を示した。骨石灰化の変化は用量依存性を示した。

より良い染色効果と観察のためには、ゼブラフィッシュ幼虫の元の色素を取り除き、漂白後に泡を取り除くことが重要です。