Использование красного окрашивания Alizarin для обнаружения химически индуцированной потери костной массы у личинок рыбок данио

Этот метод может помочь обнаружить костную токсичность, вызванную химическими веществами у рыбок данио. Ализарин Красное окрашивание неподвижной ткани генерирует постоянную запись скелетных изменений, которая может облегчить сравнение нескольких образцов. Этот метод может быть полезен для изучения остеопороза в модели рыбок данио, поскольку одной из характеристик остеопороза является уменьшение костной массы.

Удалите 10 личинок рыбок данио случайным образом из каждой группы через девять дней после оплодотворения и зафиксируйте рыбу в одном миллилитре 2% параформного альдегида и 1X PBS в течение двух часов. Деканировать раствор и промыть личинку рыбок данио, используя 100 миллимоляров Tris HCL с рН 7,5 или 10 миллимоляров хлорида магния. Для окрашивания декантируют раствор и инкубируют личинку в течение пяти минут в серии растворов, как описано в рукописи.

После окончательной инкубации декантируют раствор и удаляют пигмент путем отбеливания раствором, состоящим из 3% перекиси водорода и 0,5% гидроксида калия. Наблюдают один раз в 10 минут, пока пигмент не будет полностью удален. Промыть личинку рыбки данио несколько раз 25% глицерином, 0,1% гидроксидом калия в течение 10 минут каждый, пока не останется пузырьков.

Окрашивают в личинку путем замачивания в одном миллилитре 0,01% ализарина. Декантировать раствор и добавить один миллилитр 50%-го глицерина или 0,1%-го гидроксида калия для очистки фона. Хранить рыбу в свежем 50% глицерине или 0,1% гидроксида калия для последующего наблюдения.

Переносите по одной личинке за раз на стеклянную горку, удерживая личинку в середине капли жидкости. Понаблюдайте за личинкой под стереомикроскопом. Включите фотокамеру.

Откройте программное обеспечение и сохраните настройки по умолчанию. Нажмите на AE и выберите подходящее время экспозиции, чтобы получить лучшее изображение. Захват всех изображений с одинаковыми настройками.

Сохраните изображения в формате dot tiff для последующего анализа. Дважды щелкните значок imageJ. Чтобы проанализировать сохраненные изображения, нажмите на файл, затем откройте, затем нажмите на изображение, затем введите и выберите восьми бит.

Нажмите на редактирование и инвертируйте. Нажмите на анализ, затем откалибруйте. Выберите Некалиброванный OD во всплывающем интерфейсе.

Проверьте глобальную калибровку в левом нижнем углу нижнего интерфейса и нажмите кнопку «ОК». Нажмите «Анализировать», установите масштаб, затем удалите масштаб. Проверьте глобальный ниже и нажмите OK.

Нажмите на анализ, затем установите измерения. Выберите область элемента во всплывающем интерфейсе. Установите предел до порогового значения ниже, чтобы измерить только выбранный диапазон, и нажмите кнопку «ОК».

Нажмите на изображение, отрегулируйте, затем порог и сдвиньте ползунок в середине всплывающего интерфейса. Чтобы выбрать соответствующее пороговое значение, чтобы были выбраны все цели, которые будут тестироваться в одном изображении. И нажмите кнопку Установить.

Нажмите на анализ, затем измерьте, сохраните даты. Alizarin Red Staining - это чувствительный и специфический метод измерения изменений минерализации костей у личинок рыбок данио. Через девять дней после оплодотворения многие кости скелета головы, такие как парасфеноидные, оперкулярные, цератобранхиальные и нотохорды, минерализуются и, следовательно, окрашиваются в красный цвет.

Напротив, некостные структуры, такие как отолиты, кажутся коричневыми черными. Цифровой анализ, проведенный для количественной оценки общей окрашенной площади, показал значительное уменьшение окрашенной площади для групп обработки ацетатом свинца на 10 и 20 миллиграммов на литр. Изменения в минерализации костей показали дозовую зависимость.

Для лучшего эффекта окрашивания и наблюдения важно удалить исходный пигмент личинок рыбок данио, а также удалить пузырьки после обесцвечивания.