Uso de tinción de rojo de alizarina para detectar la pérdida ósea inducida químicamente en larvas de pez cebra

Este método puede ayudar a detectar la toxicidad ósea inducida por productos químicos en el pez cebra. La tinción de rojo de alizarina de tejido fijo genera un registro permanente de cambios esqueléticos que pueden facilitar las comparaciones de varias muestras. Esta técnica podría ser útil para estudiar la osteoporosis en el modelo de pez cebra, ya que una de las características de la osteoporosis es la disminución de la masa ósea.

Retire 10 larvas de pez cebra al azar de cada grupo a los nueve días después de la fertilización, y fije el pez en un mililitro de aldehído paraformado al 2% y 1X PBS durante dos horas. Decantar la solución y lavar la larva de pez cebra utilizando 100 milimolares Tris HCL con un pH de 7,5 o 10 milimolares de cloruro de magnesio. Para la decoloración, decantar la solución e incubar la larva durante cinco minutos en una serie de soluciones como se describe en el manuscrito.

Después de la incubación final, decantar la solución y eliminar el pigmento blanqueando con una solución que consiste en 3% de peróxido de hidrógeno e hidróxido de potasio al 0,5%. Observe una vez cada 10 minutos hasta que el pigmento se elimine por completo. Enjuague la larva de pez cebra varias veces con 25% de glicerina, hidróxido de potasio al 0,1% durante 10 minutos cada uno hasta que no haya burbujas.

Mancha en la larva remojándola en un mililitro de 0,01% de Alizarina. Decantar la solución y agregar un mililitro de 50% de glicerina o hidróxido de potasio al 0,1% para limpiar el fondo. Almacene el pescado en hidróxido fresco al 50% de glicerina o 0,1% de potasio para su posterior observación.

Transfiera una larva a la vez al portaobjetos de vidrio manteniendo la larva en el medio de la gota de líquido. Observe la larva bajo un microscopio estereoscópico. Encienda la cámara.

Abra el software y mantenga la configuración predeterminada. Haga clic en AE y elija un tiempo de exposición adecuado para obtener la mejor imagen. Capture todas las imágenes con la misma configuración.

Guarde las imágenes en formato punto tiff para su posterior análisis. Haga doble clic en el icono imageJ. Para analizar las imágenes guardadas, haga clic en el archivo, luego ábralo, luego haga clic en la imagen, luego escriba y seleccione ocho bits.

Haga clic en editar e invierta. Haga clic en analizar, luego calibrar. Seleccione OD sin calibrar en la interfaz emergente.

Compruebe la calibración global en la parte inferior izquierda de la interfaz inferior y haga clic en Aceptar. Haga clic en analizar, establecer escala y, a continuación, eliminar escala. Marque global a continuación y haga clic en Aceptar.

Haga clic en analizar y, a continuación, establezca las medidas. Seleccione el área del elemento en la interfaz emergente. Marque el límite al umbral a continuación para medir solo el rango seleccionado y haga clic en Aceptar.

Haga clic en la imagen, ajuste, luego en el umbral y deslice el control deslizante en el centro de la interfaz emergente. Para seleccionar el umbral adecuado para que se seleccionen todos los objetivos que se van a probar en una imagen. Y haga clic en establecer.

Haga clic en analizar, luego mida, guarde las fechas. La tinción roja de alizarina es un método sensible y específico para medir los cambios en la mineralización ósea en larvas de pez cebra. A los nueve días después de la fertilización, muchos huesos del esqueleto de la cabeza, como el paraesfenoides, el opercular, el ceratobranquial y la notocorda, se mineralizan y, por lo tanto, se tiñen de rojo.

En contraste, las estructuras no óseas como los otolitos, aparecen de color negro marrón. El análisis digital realizado para cuantificar el área total teñida, mostró una disminución significativa en el área teñida para los grupos de tratamiento de acetato de plomo de 10 y 20 miligramos por litro. Los cambios en la mineralización ósea mostraron dependencia de la dosis.

Para un mejor efecto de tinción y observación, es importante eliminar el pigmento original de las larvas de pez cebra y eliminar las burbujas después del blanqueo.