この手法により、模擬微小重力が免疫細胞に及ぼす影響を研究し、宇宙環境の側面が分子レベルで人間の生理機能にどのように影響するかをよりよく理解するのに役立ちます。この技術は経済的に実現可能であり、細胞培養物を宇宙に送ることや、細胞培養物を地球上でシミュレートされた微小重力にさらす他の方法と比較して、セットアップと保守が比較的簡単です。オーバーフローやこぼれを避けるために、容器を満たしながらゆっくりと進むことをお勧めします。
最初の気泡除去後、シリンジを使用して血管が完全にいっぱいになっていることを確認します。これにより、治療中に大きな気泡が形成される可能性が最小限に抑えられます。まず、プラスチック包装から培養容器を取り出します。
リムの各血管は、コントロールまたは治療のいずれにあるかにかかわらず、使用されている細胞の種類またはライン、およびその他の関連情報に従ってラベルを付けます。容器を安定させ、充填ポートキャップペグまたはOリングに触れずに充填ポートを慎重に開きます。容器が満たされている間、ペグまたはOリングを上に向けてエタノールパッドにキャップを置きます。
シリンジポートからキャップを取り外さないでください。滅菌血清学的ピペットを使用して、細胞培養に適した完全培地10 mLを容器にロードし、キャップを充填ポートに慎重に置きます。シリンジポートキャップと充填ポートがしっかりと閉じていることを確認します。
次いで、充填された容器をインキュベーターに入れ、その後の工程を行いながら、細胞培養のために容器をプライミングする。培地プライミング容器をインキュベーターから取り出します。フラスココントロールの場合は、上記で調製したストックから10 mLの細胞培養物をT25浮遊培養フラスコにロードします。
10 mLのストック細胞培養液を、シリンジのロードに使用する別の15 mLコニカルチューブに追加します。シリンジポートキャップを緩めて容器から取り外し、ストック活栓が開いた位置にあることを確認します。容器を安定させ、充填ポートキャップペグまたはOリングに触れずに充填ポートを慎重に開きます。
容器が満たされている間、ペグまたはOリングを上に向けてエタノールパッドにキャップを置きます。活栓が開いた位置にあることを確認してください。容器は、血清学的ピペットを使用して容器から廃棄物容器に培地を注ぐことによって空にすることができる。
または、真空システムに取り付けられたピペットを通過させる滅菌ガラスを使用して培地を吸引します。ピペットや真空システムを使用しているときは、酸素化膜が損傷し、容器が使用できなくなる可能性があるため、触れないようにしてください。調製したストック細胞培養物を含む50 mLコニカルチューブをしっかりと閉じ、ゆっくりと数回反転させて内容物を完全に混合します。
新鮮な滅菌血清学的ピペットを使用して、50 mLチューブから10 mLの細胞培養ストックを引き出します。容器を持ち上げて傾け、充填口が上を向くようにします。次に、細胞培養ストックを充填ポートから容器に慎重に分注します。
こぼれないように容器を後ろに傾けながら、容器を充填ポートの先端まで充填します。ピペットで酸素化膜は非常に壊れやすいので触れないように注意してください。容器に積み込まれたら、Oリングに触れずに充填ポートキャップを慎重に元に戻します。
最初の3 mLシリンジをパッケージから取り出し、数回ポンプで押して緩めます。次に、シリンジをシリンジポートの1つに取り付け、シリンジが完全に押し下げられていることを確認します。10 mLのアリコート細胞培養物を含む15 mLのコニカルチューブをしっかりと閉じ、ゆっくりと数回反転させて内容物を完全に混合します。
同様に、2番目の3 mLシリンジをパッケージから取り出し、数回ポンプで送ります。次に、このシリンジを15 mLコニカルチューブから細胞培養物に注意深く半沈め、培養液を吸引します。シリンジを完全にチューブに分注し、3 mLの培養液を吸引することで、気泡を最小限に抑えます。
充填されたシリンジを残りのシリンジポートに取り付け、シリンジと充填ポートの周囲をエタノールパッドで慎重に消毒します。酸素化膜にエタノールが付着しないでください。残りの容器についてもこのプロセスを繰り返します。
最後の容器の50 mLコニカルチューブに細胞培養がわずかに不十分に残っている場合は、シリンジのロードに使用した15 mLコニカルチューブから残りの量を回収します。シリンジポートの活栓を閉じて、シリンジから血管への細胞と気泡の移動を制限します。容器を逆さまにして数回横に叩いて、最初の泡を集めます。
容器をすばやく後ろにひっくり返して上向きにし、次に反対側を向いてわずかな角度で、泡がすべて容器の上側に浮くようにします。空の注射器でポートの下の泡を操作し、それらがポートに入り始めるのを見てください。両方のシリンジポート活栓を開きます。
容器をそっと叩いて、泡が空の注射器に浮かぶのを促します。空のシリンジで大きな気泡をゆっくりと吸い上げながら、シリンジ全体を慎重に押し下げて容器内の圧力を維持し、酸素化膜が破裂しないようにします。このプロセスを数回繰り返して、すべての気泡が除去されていることを確認します。
気泡が効果的に除去されたら、シリンジポート活栓を閉じます。治療中はシリンジをオンのままにして、その後の気泡除去を可能にし、両方のシリンジの容量がほぼ等しくなるようにします。回転ベースとリボンケーブルの表面を70%エタノールで慎重に拭き取ります。
リボン ケーブルが電源装置に接続されていることを確認します。回転ベースをインキュベーターに入れ、リボンケーブルをベースに取り付けます。電源をインキュベーターの近くに置きますが、インキュベーターの外側に置きます。
容器のねじ山を回転ペグに合わせ、ベースの回転ペグを反時計回りにゆっくりと回して、SMG処理容器を取り付けます。容器がしっかりと取り付けられていることを確認してください。オートクレーブRO水で水トレイを満たして、インキュベーターを湿度約100%に維持します。
細胞が培地から落下しないように、細胞の沈降速度に合わせてインキュベーターの回転速度を調整します。治療開始の初日は、本文に記載されているように、数時間ごとに気泡の形成を確認します。希望の治療期間が終了するまで、少なくとも1日1回泡を取り除きます。
計画された処理時間が経過したら、回転を停止して装置を分解します。装置の回転ペグを時計回りに回しながら容器を静かに静止させて、治療容器を取り外します。コントロールフラスコ、コントロール、および処理された容器を滅菌生物学的安全キャビネットに入れます。
コントロールフラスコを除く各容器を取り、下向きになるように裏返します。次に、それを静かに叩いて、すべての細胞を懸濁させます。次に、充填口を下に向けて容器を横向きに回転させ、もう一度叩いてセルを充填口に導き、効率的な吸引を実現します。
各容器を個別に取り扱います。2つのポートからシリンジを外し、バイオハザード廃棄物に分注します。シリンジポートの活栓を開きます。
充填ポートキャップを慎重に取り外し、滅菌済みの10 mL血清学的ピペットを使用して内容物を吸引し、容器が空になったら傾けます。すべての対照群と治療群の内容物を、個別にラベル付けされた15mLコニカルチューブに分注します。各チューブを閉じ、数回静かに反転させて、適切に混合されていることを確認します。
得られた細胞培養物の濃度および生存率を決定するための好ましい方法を使用して、その後の実験アッセイの準備をします。NK-92細胞株の開始生存率および着座密度を、得られた終末生存率および終末濃度と比較した。72時間のSMG治療後、陰性と陽性転帰の2つの事例が比較された。
比較のために、使用したNK-92細胞株の最適濃度範囲は、ミリリットルあたり0.3〜120万細胞であり、倍加時間は約2〜3日でした。SMG治療群の増殖は、対照群と治療群でほぼ同等でした。.これらのパラメータは、下流の実験の成功に不可欠であり、2つの対照群から得られた細胞は、下流の実験アッセイで同様に実行されました。
治療の過程を通して、特にシミュレートされた微小重力にさらされている細胞培養において、気泡の形成を監視し、考慮することが重要です。大きな気泡の形成は、容器内の流体力学に混乱を引き起こす可能性があり、これは本質的にシミュレートされた微小重力状態を無効にします。
