このプロトコルは、魚の毒性試験におけるさまざまな潜在的なアプリケーションを持つ3Dインビトロモデルであるゼブラフィッシュスフェロイドを簡単に生成できます。これは、サイズと形状が非常に類似したゼブラフィッシュ細胞株の単一スフェロイドを生成するための簡単で高速な方法です。説明されているすべての手順を正しく実行すれば、問題は発生しないはずです。
ゼブラフィッシュスフェロイドは、魚に対する化学物質の影響のメカニズム、探索に大きく利益をもたらし、化粧品などの製品の環境安全性評価を改善するのに役立ちます。手順を実演するのは、私の研究室の遺伝学の医師であるイリスドリス・ロドリゲス・デ・ソウザです。まず、ゼブラフィッシュ細胞のT75フラスコを約80%のコンフルエントで取ります。
完全培地を除去し、ピペットで培養フラスコに0.01モルPBSを加えて細胞を洗浄する。フラスコを静かに振って培養フラスコをPBSで洗浄し、PBSを取り外します。培養フラスコに3ミリリットルのトリプシン0.5ミリモルEDTAを加え、摂氏28度で3分間インキュベートします。
フラスコから細胞を剥離するには、フラスコを軽くたたいて細胞を放出します。次に、3ミリリットルの完全培養培地をフラスコに加えて、トリプシン消化を停止します。ピペットを使用して、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐形遠沈管に移し、100Gで5分間遠心分離します。
その後、上清を慎重に取り除きます。使用中の各細胞株用の完全培地を1ミリリットル加え、マイクロピペットを用いてペレットを再懸濁する。10マイクロリットルの細胞懸濁液と10マイクロリットルのトリパンブルー色素をマイクロチューブに加えて、細胞をカウントし、生存率を評価します。
ピペットを使用して細胞懸濁液と色素を混合し、この混合物10マイクロリットルをノイバウアーチャンバーに移します。チャンバーの隅に配置された4つの大きな正方形または象限の細胞を数え、トリパンブルーを摂取しない細胞を生存可能と見なします。次に、画面に表示されている式を使用して生細胞数を計算します。
この細胞数に2を掛けて、細胞懸濁液中の最終的な細胞数を計算します。細胞数を算出した後、各細胞株に必要な細胞数を有する96ウェル丸底ULAプレートのウェル当たりこの懸濁液を200マイクロリットルプレートに調整するように細胞懸濁液を調整した。培地リザーバー内の細胞濃度を調整して懸濁液を調製し、泡または気泡を形成することなくマルチチャンネルマイクロピペットを使用して混合する。
200マイクロリットルの調整した細胞懸濁液を丸底ULAプレートの各ウェルに加える。マルチチャンネルピペットを使用する。プレートは、96ウェルプレートからの培地の蒸発を防ぐために、パラフィルムまたは接着剤シーリングフォイルで密封する必要があります。
二酸化炭素を含まない摂氏28度のインキュベーターで5日間、70 RPMのオービタルシェーカーでプレートをインキュベートします。5日後、倒立光学顕微鏡でスフェロイドを観察し、生成されたスフェロイドを評価した。それらの形状とサイズを測定するには、回転楕円体の画像を取得し、ソフトウェアを使用して画像を処理および分析します。
既知のスケールに基づいて選択した領域を測定するようにソフトウェアを設定した後、回転楕円体の外側を選択して、その面積と円形度を決定します。回転楕円体の面積は、直径dを計算することによってそのサイズを決定するために使用され、ソフトウェアは、選択された面積と周長を使用する式によって回転楕円体の真円度を提供します。ZFL細胞凝集体は、軌道振盪の初日に形成される。
細胞凝集体は3日目に円形性を高め、5日目に適切な回転楕円体形状に達する。ULAプレート中の16日齢のZFLスフェロイドがここに示されています。ZEM2S細胞株は、眼窩振盪の初日からスフェロイドを形成します。
回転楕円体は3日目にその形状を維持し、サイズが大きくなり、5日目に最大円形度に達します。ULAプレート中の10日齢のZEM2Sスフェロイドがここに示されています。ZFLおよびZEM2S細胞株のスフェロイドの測定サイズおよびZFLおよびZEM2Sスフェロイドの測定された円形度指数をこの図に示す。
このグラフィック画像は、ZFLおよびZEM2Sスフェロイドの成長パターンを表しています。ここでは、100 RPMで5日間の軌道振動の後に形成されたZFLスフェロイドとZEM2Sスフェロイドを示します。70および100RPMの回転速度で形成されたスフェロイドの成長パターンおよび円形度指数をこの図に示す。
70 RPMは、この方法でZFLおよびZEM2Sスフェロイドを形成するのに最も適切な速度です。レクチンAlexa Fluor 594による細胞膜の染色とDAPIによる核の染色は、スフェロイドのコアにおける細胞の完全性を示しています。AlamarBlueの還元によって形成されたレゾルフィンの蛍光は、両方のスフェロイドのコアに生細胞を示します。
ZEM2SおよびZFL細胞株の3D培養および2D培養におけるMTT生存率アッセイがここに示され、有意差がないことが示されている。この手順を試みるときは、培地のpHが変化したり、ウェル内の蒸発が起こらないように、プレートを密封してください。スフェロイドは、魚の肝臓における毒性作用を評価するためのさまざまなin vitroアッセイや、胚ZEM2S細胞株を用いた発生研究に適用できます。
このプロトコルは、in vitro魚試験の開発を推進するのに役立ち、動物ベースの生態毒性試験の進歩に貢献します。
