H反射は、神経回路の完全性の電気生理学的検証を可能にします。マウスの前足の神経でのH反射を直接定量化するための終末プロトコルを提示します。従来のかなり神経非特異的な経皮的記録とは異なり、結果はマウスと測定日の間であまり変動しません。
患者のH反射記録と同様に、正確な定量化により、脊髄損傷や脳卒中などの疾患モデルでの電気生理学的特性評価が可能になります。このプロトコルには、マウスの手術器具を扱う際の確かな実験スキルが必要です。
結合組織や血管から神経を分離する方法がわからない場合は、最初に練習してください。手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士課程の学生であるフレデリック・ウィータースによって行われます。まず、成人の麻酔をかけた8〜16週齢のC57ブラック/ 6Jマウスをカバー付きの加熱パッドに置き、マウスが落ち着き、呼吸が安定し、反射神経がなくなるまで待ちます。
マウスを背中に向けます。次に、前足をテープで固定します。測定電極が前足に簡単に挿入されるようにテープを配置します。
マウスの温度を測定するには、直腸プローブを挿入し、テープで固定します。目の乾燥を防ぐために目の軟膏を塗ります。ピンセットで皮膚を持ち上げながら、細かい丸みを帯びたはさみで毛皮を慎重に取り除きます。
続いて、一対の細かい丸みを帯びたハサミで前足の腹後軸に沿って皮膚を1センチメートル切開する。結合組織を慎重に取り除き、下の筋肉と神経を露出させます。次に、鉗子を使用して露出した前胸筋を取り除き、正中神経を評価します。
軟ティッシュペーパーで少量の血液と組織液を取り除きます。次に、乳房または腋窩の筋肉を上から下に慎重に切断して、神経束を露出させます。約1.5センチメートルの長さにわたって結合組織および筋肉組織から神経束を解放します。
曲がったガラスピペットを使用して、前足の尺骨神経と正中神経を慎重に分離します。上の神経は尺骨神経で、下の神経は正中神経です。刺激フック電極を0.5〜1ミリメートルの距離で平行に配置し、マイクロマニピュレーターを使用してダブルフックを神経の近くに配置します。
ガラスフックを使用して尺骨神経を刺激フック電極に持ち上げます。次に、神経で電極を引き戻し、他の神経から分離します。筋肉間のクロストークを減らすために、足の長軸に沿って電極を配置します。
神経に取り付けられた電極フックを表面的に乾燥させ、シリンジを使用してワセリンを塗布して、隣接する組織から電気的に絶縁します。H反射を測定するには、筋電図電極を前足の筋肉内に配置します。次いで、参照電極を後肢の皮下に配置し、小型のワニ口クリップで保持する。
刺激装置がオンになったら、前足の小さなけいれんとして成功した刺激を観察します。M波と前足の小さな目に見えるけいれんを引き出すための最小刺激電流は、10〜50マイクロアンペアです。神経刺激をそれぞれ0.2ミリ秒の長さのパルスで15回実行します。
刺激のセットの間に2分間の休止で、周波数は0.1、0.5、1.0、2.0、および5ヘルツに増加します。ホフマン反射と筋肉反応を測定するための経路で設定された記録の図がここに示されています。H波振幅とM波振幅の比を評価した。
刺激とそれぞれの刺激アーチファクトはゼロミリ秒に設定され、その後に直接M波とそれに続くH波を表す小さなピークが続きました。M波は刺激後約2ミリ秒で発生し、H波は脊髄を通過する時間が長いため6〜8ミリ秒後に発生します。神経の分離の次に、電極へのワセリンの適用と2つのフック間の適用が重要です。
これは最終実験です。私たちの研究室では、この技術は経皮的H反射記録への新しいゴールドスタンダードのリファレンスを提供しました。
