FILM-FRETは、疑わしいタンパク質相互作用または予測タンパク質相互作用を確認することを可能にする強力な技術です。このプロトコルでは、特に不均衡なドナーと受入者の量のデータを分析する方法を提示する。FILM-FRETは、生きた細胞内でタンパク質とタンパク質の相互作用に関する情報を直接提供することができます。
特に蛍光タンパク質が内因性レベルで発現する場合、ネイティブの細胞環境における個人とタンパク質の相互作用を調べるのが重要です。P.aeruginosa、大腸菌TOP10、大腸菌ヘルパー細菌を、一晩で揺れながら摂氏30度で抗生物質なしで5ミリリットルのLBで成長させることから始めます。翌日、培養物の光学密度を測定し、1.5ミリリットルマイクロチューブにP.aeruginosa、大腸菌TOP10、大腸菌ヘルパーを同量混合します。
チューブを9時に5分間、Gを300回遠心して細菌をペレット化し、その上清を捨て、LBの50マイクロリットルでペレットを再懸濁する。予熱したLB寒天に混合物のスポットをプレートし、摂氏37度で5時間インキュベートします。インキュベーションの後、滅菌接種ループでスポットを削り、LBの1ミリリットルで再懸濁します。LB寒天にこの細菌懸濁液のプレート100マイクロリットルは、1ミリリットルクロラムフェニコールあたり10マイクログラムと1ミリリットルゲンタマイシンあたり30マイクログラムを含み、大腸菌TOP10および大腸菌ヘルパー細菌を排除するために摂氏37度で2日間インキュベートする。LBの1ミリリットルに1コロニーを再中断し、4時間軌道揺れで摂氏37度でインキュベートし、9時間、300倍Gで3分間チューブを遠心分離し、950マイクロリットルの上清を捨てます。
LBの50マイクロリットルでペレットを再懸濁し、スクロースと塩化ナトリウムを含むLB寒天上の混合物を分離します。プレートを摂氏30度で一晩インキュベートします。スポット LB 寒天と LB 寒天に分離されたコロニーを含む 15 ピリミシン 1 ミリグラムを含むゲンタマイシンの感度をチェックします。.
顕微鏡のガラススライドを平らな水平面に置き、2層の粘着テープを貼った2枚のガラススライドを配置します。ピペット1%の70マイクロリットルの液滴をガラススライドに溶かし、4番目のスライドを上に置いてアガロース液滴を平らにする。1分ほど軽く押し下げます。
上のスライドを外し、アガロースパッド上の異なる場所で3〜4つの場所に細菌の約3マイクロリットルを落とします。アガロースパッドを顕微鏡ガラスカバースリップで覆い、溶かしたパラフィンで固定し、4つのコーナーから始めてガラススライドに密封します。カバースリップを目的に向けてステージ上に顕微鏡スライドを置きます。
フィルターキューブタレットを回してeGFPキューブを選択し、蛍光ランプシャッターを開けてから、蛍光灯を顕微鏡の接眼部に向けて送ります。顕微鏡ノブを使用して細菌に目的を集中させます。電動ステージを制御するジョイスティックを使用して、サンプル内の対象地域を選択します。
蛍光発光経路を検出器に戻し、フィルターキューブタレットを引き返して930ナノメートルレーザーの二色キューブを選択し、レーザーパワーを20ミリワットに設定します。ガルボミラーを動作する電圧を調整し、その動きの範囲を定義する30マイクロメートルに関心領域のサイズを設定します。検出器の電源を入れ、サンプルのスキャンを開始します。
コンピュータインターフェイスからステージを細かく移動して、イメージングの視野を選択します。これは、画像の新しい中心を定義する顕微鏡制御ソフトウェアで画像上の十字を移動し、移動段階を押すことによって、セットアップ上で行うことができます。取得のための良い視野は、すべての焦点で10〜30の不動細菌を含む必要があります。
単一細胞のフィルム-FRETデータを抽出することに興味がある場合は、細菌が十分に個別化されていることを確認してください。イメージングソフトウェアを開き、寿命測定に影響を与える可能性のある積み重ね効果を避けるために、光子数が高すぎないことを確認します。必要に応じて、レーザー強度を下げて光子数を低く抑えます。
取得収集時間を含む取得パラメータを調整します。スタートボタンを押して、取得が完了するのを待ちます。データを分析するには、RStudio を開き、新しいプロジェクトを作成します。
メインプロジェクトフォルダに新しいフォルダを作成し、dataという名前を付け、すべての分析質問ファイルをこのフォルダに移動します。新しいスクリプト ファイルまたは補助スクリプト flim_analysis.r を開きます。フィルムデータ分析用の専用FlimDiagRamパッケージをインストールし、ワークスペースでパッケージを呼び出します。
異なる細菌株について測定された蛍光寿命の経験的累積分布関数がここに示されている。FRET が発生した場合、関数は寿命の短い方にシフトされます。FRETは、2つのタンパク質の相互作用が2つのフルロフォア間の長距離をもたらし、相互作用の欠如と区別できない場合には発生しない点に注意することが重要です。
したがって、相互作用を探査する可能性を最大化するために、異なる位置でタンパク質を標識する必要がある場合があります。PvdAとPvdLのタンパク質表現の差が大きいため、同じ複合体は同様のフィルムFRETデータを生み出しません。アンバランスのストイチオメトリーは、記録された蛍光寿命分布における結合ドナー標識タンパク質と比較して、遊離の寄与の違いにつながります。
図のプロットは、ストイチオメトリーに関する重要な情報を提供するために使用できます。PvdA-eGFP mCherry-PvdL変異体では、ドナー標識PvdAの量はmCherry-PvdLの量よりもはるかに高い。サンプルに存在するすべてのドナーの中で、それらのほんの一部だけがPvdLと相互作用している。
約2.3ナノ秒を中心とする単一のタウ1つの値は、各PvdA-eGFPドナーが1つのmCherry-PvdLアクセクサでしか転送できないということを示唆している。標識が逆になると、eGFP-PvdLタンパク質のほとんどは、より高いα1値によって確認されるPvdA-mCherryと相互作用することが期待される。タウ1の値は、複数のPvdAタンパク質が単一のPvdLタンパク質に結合する可能性があることを示唆するより分散された。
FLIMセットアップは、増え続けるイメージング施設で利用可能になりつつあります。フィルムFRETでのイメージングサンプルは、ビデオ顕微鏡でのイメージングと同じ複雑ではありません。
