私たちは、原稿上のコメントにジリアンスタンフィールドに感謝します。 TAJはNIHのNIGMSからユタ遺伝トレーニンググラントT32-GM007464大学によってサポートされています。

1。モザイク生成<ol><li> 遺伝的交雑 W FRT 19A浴槽 ：GAL80 FLP 122 / Y; BTL-GAL4、UAS-GFP（男性）X *を検討する変異を表し* FRT 19A / バル （メス）、。注：これは動物が適切に嵌合することができるように、実験前に少なくとも1日を越える設定します。 </li><li> プリ素人：転送クロスメディア上に置かれ、新鮮な酵母ペーストの小さな汚れとフライ食品のバイアルへ。 25℃で1時間置くことを許可</li><li> レイ：新鮮な酵母ペーストの小さな塗抹標本と新鮮なバイアルにプリ置くバイアルから動物を転送します。 25℃で6時間置くことを許可</li><li>その後の実験で貯蔵および使用のために事前に置くバイアルに戻って大人を転送します。すぐにヒートショック循環水浴中で38℃で45分間のために0-6時間古い胚を含む素人のバイアル。注：食品の表面はすべてを検証するために水位より下でなければなりません胚を適切にショックを受けて加熱されています。 </li><li> 3齢幼虫がさまよい始めるまで4-5日間25℃でヒートショックバイアルをインキュベートする。 </li></ol> 2。モザイク動物用の画面<ol><li>細かい鉗子を使用すると、静かにバイアルの側面から放浪サード齢幼虫を選んで、小さなプラスチック板でチルド100％グリセロールにそれらを配置します。 </li><li>蛍光光学系を搭載した高倍率·解剖顕微鏡を使って幼虫を調べます。蛍光標識された気管の細胞のモザイク表現で幼虫を識別します。通常、これは10〜20倍の倍率で行うことができる。 </li></ol> 3。熱固定<ol><li>細かい鉗子を使用して慎重に75x25x1 mmの白いガラスの顕微鏡スライド上に新鮮な100％のグリセロールのドロップディッシュと場所のモザイク動物を選び出す。注：複数の動物を降下（ 図1A）に配置することができる。 動物はまた、カバースリップ上に直接グリセロールの低下に配置することができ動物は非常に迅速に加熱され、オーバー固定になることができるとしてではなく、ケアが、固定（ステップ3.2）中に撮影されなければならない。 </li><li>動物まで、70℃のヒートブロック上に配置したスライドガラスは、単にカバースリップ（ 図1B）のためにスライドし、10秒間、何以上20秒移動しない停止。動物は、最初は身をくねらせますが、停止して、剛性と細長い一度死んだようになります。注：熱過ぎる暴露は、端末の枝やルーメンを損傷するだけでなく、薄暗いと拡散GFPシグナルを作ります。最適な効率のためには、顕微鏡と同じ部屋にヒートブロックを持っていることをお勧めします。 </li><li>オリエントは慎重にスライド上のすべての幼虫が互いに（ 図1C）に平行に配向しているような一方向にドロップ全ての幼虫を、細かい鉗子を使用する。 </li><li>そっと幼虫の上部（またはスライドガラス上にカバースリップを反転）に18x18mmマイクロカバーガラスを配置し、気泡を形成します（ 図1D）を避ける。注：カバースリップは、正確に嘘をつかないこと幼虫以上フラット、これは問題ではありません。 </li><li> 30分以内に撮影幼虫。熱固定端末セルが劣化するとGFP信号が極めて拡散になるであろう。 </li></ol> 4。気管ターミナル細胞のin vivoイメージング <ol><li>複合実体顕微鏡のステージ上でスライドを置きます。動物の背側表面（ 図1F）で後部に前方から実行している2つの平行背トランクを見つけ5X対物レンズを用いて。直接2背トランクの間に2つの背側の端子セルを探します。これは、分析のための適切なセグメントを識別するのに役立ちます。 </li><li>一度指向、画像希望の端末細胞に動物を回転させます。これを行うには、慎重にゆっくりとカバースリップ（ 図1Eおよび1G）の下に幼虫を転がり、幼虫の長軸に鉗子垂直な端にカバースリップを押してください。 </li><li>適切な端子セルを選択すると、一貫性のある結果を得るために重要であると変異体間の比較。体脂肪ブランチ（FB）端子細胞が簡単に正中線に横背トランクに隣接発見されています。横グループG端子細胞は（LG）を簡単に発見されたと腹側正中線（ 図1H）のちょうど横に位置しています。注：ほとんどの前方（Tr1部）と後部（Tr10を）セグメントにおける端末セルの配置が他のセグメントから発散です。我々は唯一のセグメントTr2を-Tr9の、端末細胞を分析する。背ターミナル細胞は他の気管の端末細胞よりステレオタイプの分岐パターンを持っている。これは、付加的、非細胞自律的な信号に依存することが、分析に含めるかどうかを決定する際にこれを考慮すべきである。 </li><li>その他の端末のセルが識別されたら、所望の倍率を使用してイメージをキャプチャ、典型的には10X又は20X（ 図2A）が最適である。注：変数分岐パターンに起因するが、できるだけ多くの枝と枝のヒントとして含める画像をキャプチャしよう。 </li><li>ステージを移動させずに、蛍光のスイッチをオフにし、同じセルと焦点面（ 図2B）の明視野画像をキャプチャするために透過光をオンにします。ルーメンは暗くターミナルセル空間内対照として視覚化されます。末端細胞の枝やルーメンを定量化することを計画している場合は、各端末のセルの複数の焦点面に複数の画像を収集しています。 </li></ol> 5。 ImageJのを使用してターミナル細胞形態の分析と定量<ol><li> ImageJの（用いた蛍光と明視野画像を開き<a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ）NeuronJプラグイン（ <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/" target="_blank">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/を</a> ）。 </li><li> &quot;追加トレーシング&quot;ツールを使用して、手動で端末全体の細胞の枝や内腔をトレースします。 </li><li> &quot;ラベル·トレーシング&quot;ツールを使用して、名前の変更およびrトレース内の特定の指定を各ラインを割り当てるecolor。 </li><li> &quot;パラメータ設定&quot;ツールを使用して、6-10ピクセルから線幅を調整（複合顕微鏡に接続されたデジタルカメラから得られた512×512の画像のために。高いか低い解像度のカメラでは、ピクセル幅が適切にスケーリングする必要があります）、すべてを使用してその他のデフォルト設定、および &quot;OK&quot;を選択します。その後、画像を取るために &quot;スナップショットの作成&quot;ツールを使用します。オリジナルと並べて表示することができるトレースのスナップショットを取得するには、 &quot;トレースを描く&quot;を選択します。 </li><li> &quot;測定トレーシング&quot;ツールを選択して、トレースタイプ（ すなわちステップ5.3で割り当てられた固有の名称に基づいて測定するためにどの枝）を選択します。次に、 &quot;RUN&quot;をクリックしますと &quot;クリア以前の測定&quot; &quot;トレースの測定値を表示する&quot;を選択します。これは、名前、ラベルの長さ（ピクセル単位）、およびイメージの他のデータを含むスプレッドシートを生成する。このデータは、さらに、統計のためのMicrosoft Excelスプレッドシートとして保存することができます分析。 </li></ol>

<ol>
	<li>Manning, G., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+Tracheal+System.">Development of the Drosophila Tracheal System.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).</li><li>Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+regulation+of+airway+branching+in+Drosophila+is+mediated+by+branchless+FGF.">Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF.</a> Cell. 99 (2), 211-220 (1999).</li><li>Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+interactions+among+epithelial+cells+during+tracheal+branching+morphogenesis.">Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis.</a> Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).</li><li>Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Zpr1+(Zinc+Finger+Protein+1)+Is+Required+Downstream+of+Both+EGFR+And+FGFR+Signaling+in+Tracheal+Subcellular+Lumen+Formation.">Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).</li><li>Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+screen+for+tube+morphogenesis+and+branching+genes+in+the+Drosophila+tracheal+system.">A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).</li><li>Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonal+genetic+screen+for+mutants+causing+defects+in+larval+tracheal+morphogenesis+in+Drosophila.">A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila.</a> Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).</li><li>Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whacked+and+Rab35+polarize+dynein-motor-complex-dependent+seamless+tube+growth.">Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth.</a> Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).</li><li>Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+talin+and+integrin+genes+are+required+for+maintenance+of+tracheal+terminal+branches+and+luminal+organization.">Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization.</a> Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).</li><li>Jones, T. A., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+the+PAR+complex+in+subcellular+morphogenesis+of+tracheal+terminal+cells+in+Drosophila+melanogaster.">A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).</li><li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell.">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+GFP/&#223;-galactosidase+fusion+protein+as+a+marker+for+morphogenesis+in+living+Drosophila.">A nuclear GFP/&#223;-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila.</a> Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).</li><li>Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -. C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+autonomy+of+HIF+effects+in+Drosophila:+tracheal+cells+sense+hypoxia+and+induce+terminal+branch+sprouting.">Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting.</a> Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利害関係を持っていないことを宣言します。

ここで説明した熱定着方式は、撮像ショウジョウバエの幼虫の気管末端細胞の迅速かつ便利なツールである。ここでは、野生型細胞の分岐とルーメンパターンを調べるためにこのテクニックを使用しています。 息気管特異的プロモーターによって駆動GFPを発現する気管細胞は熱固定後の幼虫のクチクラを通じて簡単に可視化することができる。特定の分岐個別端末のセルのパタ...

セル形状は、組織または器官の一部として、個々の生体内の細胞、ならびに細胞機能の機能にとって重要である。分岐管形成および（lumenogenesis）：我々は、細胞の形態の2つの保存種類の制御に関与する分子機構を調べるためにショウジョウバエ気管末端細胞、昆虫呼吸器システムの構成要素を使用する。端子細胞は、機能が内部組織1に酸素を提供し、標的組織内のローカル2酸素レベルによって制御されるFGFシグナル経路に依存する精巧な分枝状形態を有するようにすること分岐状のチューブネットワークの先端に配置されている。ターミナル細胞の枝には、各ブランチを介して実行してガスを充填した細胞内腔と、細い管である。遺伝子解析がショウジョウバエにおいて実行される際の容易性と共に端末細胞の別個のセルラーアーキテクチャでは、これらの細胞の優れたモデルfを行うまたは、細胞の伸長のメカニズムを調査して分岐し、細胞内の管形成。端末細胞は、分枝状細胞分化、伸長、および成熟2-4に至るシグナル伝達経路のいくつかを理解するのに有用なモデルを証明している。公正このシステムを用いて、細胞形態形成変異体のための順遺伝子スクリーニングは、細胞形状5,6を制御するメカニズムについての洞察を得行われている。インテグリン媒介接着は分岐安定8に必要であること、、例えば、これらの画面には、特定のRabGAPが管腔形成とポジショニング7における細胞骨格の極性と小胞輸送に必要とされることが明らかになっていると、その上皮PAR-極性タンパク質が必要な偏光膜輸送を規制分岐と管腔形成9の両方に。端末細胞における他の研究は、非対称アクチンの蓄積と微小管の組織細胞の伸長およびlumenogenesisに必要であることが示されている<s&gt; 10まで。このように、多様な、保存された細胞生物学的メカニズムは、端末細胞形態形成に貢献しています。 ここでは、急速に、端末セル分岐と管腔形成の分析にそのままサード齢ショウジョウバエの幼虫を修正する方法について説明します。このプロトコルはまた、第1及び第2齢動物で行うことができる。この手法の鍵は、遺伝的に直接、そのまま動物の幼虫のクチクラを通じて蛍光タンパク質発現によって標識されているターミナル細胞を可視化する機能です。この手順は、このような抗体染色などの任意の定着後の操作は、細胞を観察する必要がないので、よく遺伝子または薬物スクリーニングを含む、ハイスループット分析に適している。蛍光タンパク質の発現は、細胞質で満たされた分岐の構造を明らかにする。管形成は、並列周囲を埋める流体と対照ガス充填管腔を識別する明視野顕微鏡を使用して監視することができる編組織。 このプロトコルに含まれているそれ以外の場合は未標識動物における蛍光タンパク質で標識されたホモ接合変異体端末細胞を産生するためのMARCMシステム11に基づいて、遺伝的モザイクを生成する方法である。端末細胞は、比較的遅い開発におけるそれらの複雑な構造を詳しく説明するため、これは必要であり、遺伝的モザイクは、以前の開発における他の組織における遺伝子要件のバイパスを可能にする。 。MARCMクローンを生成するには、気管がここで説明息気管固有のドライバ（BTL）12を用いて標識していると、 ショウジョウバエの X染色体のためのプロトコルであり、他の染色体のために、同様の手順である染色体に適した遺伝試薬で、使用することができます検討した。ここでは、気管細胞質局在化GFPの発現によってラベル付けされますが、手順はそのようなDsRedのような他の蛍光タンパク質の発現でも同様に動作します。 さらに、我々はニューロンの分岐パターン13を特徴付けるために開発された方法に基づいて、端末細胞の分岐パターンと管腔形成を定量化する方法が含まれている。定量的なこの種のデータは、目の肥えた正確な分岐またはlumenogenesis過程における遺伝子の役割だけでなく、さまざまな変異体9との間の直接比較を可能に重要なことができます。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioImager M1 compound microscope (or equivalent)</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Glycerol</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>M152-4L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stock</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stock</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Genotype: y w FRT19A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of drosophila larval tracheal terminal cells by light microscopy

セル形状は、細胞の機能にとって重要である。しかし、細胞の形態の重要性にもかかわらず、少し特定の形状を生成する方法を個々の細胞について知られている。 ショウジョウバエ気管末端細胞は細胞の形態を生成するために必要な遺伝子の役割を識別し、解明するための強力な遺伝モデルとなっている。端末細胞は、分岐筒ネットワークの構成要素は、内部組織に酸素を供給するように機能することを気管系である。ターミナル細胞は、彼らは二つの異なる携帯電話のアーキテクチャを持っているとして、セル形状の問題を調査するための優れたモデルです。まず、端末細胞は、複雑なニューロンと同様の精巧な分枝状の形態を有し、第二、端末のセル枝は細い管として形成され、膜結合型細胞内腔を含んでいる。端末セル枝番号、分岐組織と個々のブランチ形状の定量分析を、特定の遺伝子メカの役割に関する情報を提供するために使用することができる分枝状細胞の意思でanisms。これらの細胞における管形成の分析は、例えば脊椎動物の脈管構造のような他の管状ネットワークに共通の細管形成の保存メカニズムを明らかにすることができる。ここでは、迅速に、画像を固定するために使用することができる技術を記述し、 ショウジョウバエの幼虫内でも分枝パターンと端子細胞における管形成を分析する。これらの技術は、野生型および変異動物細胞内の端末、または遺伝子モザイクを分析するために使用することができる。このため、プロトコルの高効率化のため、それはまた、遺伝よく、RNAiのベース、またはショウジョウバエ気管系における薬物の画面に適している。

結果を図2に示す。や枝のそれぞれを介して実行してガスを充填した細胞内腔;単一横グループ（LG）ターミナル電池は広範囲細胞内分岐（GFPによって可視化）を示しています（明視野顕微鏡による可視化を、B）。これらの画像は、モザイクL3幼虫から収集セクション1及び2に記載MARCMシステムを用いて生成され、熱が固定され、結像などのセクション3及び4に記載されている。パネ?...

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Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

ここでは、気管内端末細胞の光学顕微鏡分析のための方法を提案する<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫。この方法は、動物全体の支店および内腔の形態の迅速な検査を可能にし、個々の変異体または端末細胞の発達に影響を与える変異の画面の分析に有用であろう。

の検討<em&gt;ショウジョウバエ</em光学顕微鏡で&gt;幼虫気管ターミナルセル

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

examination-drosophila-larval-tracheal-terminal-cells-light

Research

JoVE Journal

Biology

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

10.2K ビュー.  University of Utah. ここでは、気管内端末細胞の光学顕微鏡分析のための方法を提案するショウジョウバエ幼虫。この方法は、動物全体の支店および内腔の形態の迅速な検査を可能にし、個々の変異体または端末細胞の発達に影響を与える変異の画面の分析に有用であろう。

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

キイロショウジョウバエの幼虫中枢神経系の解剖

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

生物学

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

ショウジョウバエ幼虫NMJの解剖

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

ショウジョウバエ幼虫NMJ免疫組織化学

Presynaptically Silent Synapses Studied with Light Microscopy

Synaptic plasticity likely underlies the nervous system's ability to learn and remember and may also represent an adaptability that prevents otherwise damaging insults from becoming neurotoxic.  We have been studying a form of presynaptic plasticity that is interesting in part because it is expressed as a digital switching on and off of a presynaptic terminal s ability to release vesicles containing the neurotransmitter glutamate.  Here we demonstrate a protocol for visualizing the activity status of presynaptic terminals in dissociated cell cultures prepared from the rodent hippocampus.  The method relies on detecting active synapses using staining with a fixable form of the styryl dye FM1-43, commonly used to label synaptic vesicles.  This staining profile is compared with immunostaining of the same terminals with an antibody directed against the vesicular glutamate transporter 1 (vGluT-1), a stain designed to label all glutamate synapses regardless of activation status.   We find that depolarizing stimuli induce presynaptic silencing.  The population of synapses that is silent under baseline conditions can be activated by prolonged electrical silencing or by activation of cAMP signaling pathways.

Glutamatergic synapses can switch from an active mode to a silent mode. We demonstrate that presynaptic activity status in dissociated culture of rodent neurons is visualized using a fixable form of the FM1-43 dye to visualize active synapses and immunostaining with vGluT-1 antibody to visualize all glutamate synapses.

光学顕微鏡で学ぶシナプス前サイレントシナプス

Synaptic plasticity likely underlies the nervous system's ability to learn and remember and may also represent an adaptability that prevents otherwise ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

の準備ショウジョウバエ</em光学顕微鏡用> S2細胞

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

の解剖と染色ショウジョウバエ幼虫卵巣

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

幼虫活性の測定<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アクティビティモニタ

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

蛍光生細胞顕微鏡によるミトティック・マイオシス酵母核ダイナミクスの検討

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...