このプロトコルは、オシラトリアルに属する糸状シアノバクテリアが自然変換によってどのように変換され得るかを記述している。また、さまざまな種類の運動をどのように研究できるかも示しています。自然変換は、それが機能する場合、最も単純な変換手法です。
DNA、細胞、および増殖培地のみが必要です。これまでのところ、他のオシレーター列メンバーは自然変換によって変換できませんでした。私たちの研究が、他のグループが他のオシレーターを試すように刺激することを願っています。
形質転換のためには、健康的で見栄えの良い培養と良いDNA調製を行います。運動研究のために、常に超音波処理された培養物を使用してください。治療は新鮮でなければなりません。
手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるNora Weberです。まず、50ミリリットルの液体F2培地を、2つの250ミリリットルフラスコのそれぞれに、ランニング培養物からの1ミリリットルのP.lacunaフィラメントと共に接種することから始める。25°Cで約5日間、攪拌下で白色光で栽培する。
5日後、100ミリリットルのP.lacuna細胞懸濁液を10,000RPMで3分間ホモジナイズし、750ナノメートルで光学密度を測定する。次いで、細胞懸濁液を6,000倍G.Moveで15分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを残りの液体の800マイクロリットルおよび追加のF2+培地に懸濁する。1ミリリットルあたり120マイクログラムのカナマイシンを含む8つのF2 + Bacto寒天プレートと10マイクログラムのDNAを各寒天プレートの中央にピペットで取ります。
直ちにDNAの上に100マイクロリットルの細胞懸濁液をピペットする。余分な液体が蒸発するのを許すために、クリーンベンチに蓋なしで寒天プレートを保管してください。プレートを閉じ、25°Cの白色光で2日間栽培します。
2日後、各寒天プレートのフィラメントを、接種ループを用いて1ミリリットル当たり120マイクログラムのカナマイシンを含むいくつかの新鮮なF2+Bacto寒天プレートに分配する。プレートを摂氏25度の白色光で培養し、顕微鏡下で定期的に培養物を確認する。14〜28日後、死んだ茶色がかったフィラメントを特定し、顕微鏡下で形質転換フィラメントを検索します。
変換されたフィラメントは健康で緑色に見え、フィラメントの大部分とは異なります。各単一の形質転換フィラメントを、1ミリリットル当たり250マイクログラムのカナマイシンを含む10ミリリットルのF2+培地を含む50ミリリットルのフラスコに移す。シェーカーで摂氏25度の白色光で栽培し、最大4週間成長を観察します。
フィラメントを1ミリリットル当たり250マイクログラムのカナマイシンを含む寒天培地に戻し、フィラメントが成長するのを待つ。その後、カナマイシン濃度を再び上げて偏析をスピードアップする。GFP発現の場合、1本のフィラメントを蛍光顕微鏡で40倍または63倍の倍率で観察し、明視野透過像と蛍光像を撮影します。
P.lacunaをF2培地中で白色光中で50RPM水平攪拌下で、750ナノメートルでの推定光学濃度が0.35になるまで約5日間培養する。サンプルを摂氏 4 度で保存します。最大電力で1分間超音波でフィラメントを均質化し、1回のサイクルでフィラメントを均質化します。
750ナノメートルで光学密度を測定し、P.lacunaを含む培地の8ミリリットルを6センチメートルのペトリ皿に移す。サンプルが室温に達するまで数分間待ってから、ペトリ皿をセロハン箔で覆います。カメラ付きの標準顕微鏡のX-Yテーブルの上に顕微鏡スライドを置きます。
顕微鏡のライトをオンにして、4倍または10倍の対物レンズを光の経路に移動します。次に、スライドの上にペトリ皿を置きます。単一フィラメントまたはフィラメントバンドルを、テーブルの X、Y、Z の動きで調整します。
単一のフィラメントまたはバンドルの動きを観察し、標準的な顕微鏡カメラで動きを記録します。対物レンズが液体に触れていないことを確認します。6センチメートルのペトリ皿のバクト寒天表面上のP.lacunaを含む溶液のピペット0.5ミリリットル。
液体がサーフェスに入るのを待ちます。約20分後、シャーレを閉じ、4Xまたは10Xの対物レンズを使用して表面上のフィラメントの動きを観察します。眼カメラとミニコンピュータシステムを使用してタイムラプス録画をキャプチャします。
フィラメントは、最初に目で焦点を合わせ、次に眼カメラを通して焦点を合わせる必要があります。後続の画像間の時間間隔が 5 秒から 1 分であることを確認します。ミニコンピュータのLinuxスクリプトをプログラムして、タイムラプス記録を制御します。
5ミリのLEDを取り付けたLEDホルダーを用意し、下から上へ20ミリ四方の領域を照射します。LEDの強度を測定および調整します。設定全体が暗い部屋または閉じた暗い容器にあることを確認します。
P.lacunaを含む培地8ミリリットルを6センチのペトリ皿に入れ、蓋でペトリ皿を閉じ、LEDがペトリ皿の中央になるようにLEDホルダーの上に置きます。通常2日後、光処理の位置に直接向けたスマートフォンカメラでペトリ皿の画像を撮影します。ホルダーと白いシートを背景として使用して、すべての画像に同じ距離と光条件を確保します。
ImageJソフトウェアを開き、[ファイル]、[開く]をクリックしてファイルを選択します。次に、Enter キーを押します。直線ボタンを選択し、マウスの左ボタンを押して、ペトリ皿の一端から反対側の端まで線を引きます。
線がフィラメントの円の中心を通ることを確認します。[分析と測定]をクリックして、ペトリ皿の長さを確認します。次に、ImageJメニューの[プロファイルの分析とプロット]をクリックします。
円の外側のピクセル強度の平均値と、円の内側のピクセル強度の別の平均値を推定します。これらの値の間の Y 位置にマウスをポイントして、円の両側の X 値を推定します。両方の値をメモし、差を計算します。
次に、直線ボタンを選択し、ピクセル強度の最大値の中間値に線を描画します。最後に、[分析]、[測定]をクリックして、内側のセル円の長さを取得します。P.lacuna と PAK1 との変換後のインサートの統合と分離をここに示します。
形質転換の約1週間後に外側プライマーを用いたPCR試験では、通常、電気泳動ゲル上に2つのバンドがあり、1つは野生型バンドのサイズで、もう1つは耐性カセットの挿入を示すより遅い移行バンドです。ここで、レーン1~4は耐性フィラメントの単離の7日後、11日後、14日後、17日後のフィラメントのPCR産物を表し、レーン5は野生型のPCR産物を表す。7日間のサンプルでは、インサートは染色体のごく一部に存在する。
この画分は、野生型のバンドが見えない17日まで増加し、すなわち、分離は完了する。この画像は、内因性フィコシアニンβプロモーターの制御下でsfGHP発現のためのベクターpMH1を表す。p.lacuna相同配列、pUC19ベクター骨格、ならびにsfGFPおよびカナマイシン耐性を有するインサートがここに示されている。
pMH1では、sfGHP遺伝子はフィコシアニンβ遺伝子の3つのプライムに配置されているため、内因性のcpcβプロモーターによって駆動される。P.lacuna野生型フィラメントの蛍光画像、およびPAK1、PAK2、PAK3、およびpMH1による形質転換後をここに示す。sfGFPの発現は、cpc 560プロモーター、a2813プロモーター、psbA2Sプロモーター、または内因性cpcβプロモーターによって駆動される。
ここに提示されたマージされた画像は、ホルミジウムラクナの運動性を示しています。寒天表面上の動きをここに示します。時間間隔は1分であった。
液体媒体中の移動がここに提示される。時間間隔は10秒であった。自然な変換は簡単な方法です。
プラスミドDNAと耐性カセットを細胞と相同な配列で混合し、抗生物質を含む培地上で細胞を成長させるだけです。遺伝子は不活性化され、タンパク質は過剰発現され得る。これは、あらゆる基礎研究やバイオテクノロジー研究にとって重要です。
自然形質転換も確立されている単細胞シアノバクテリアでは、光合成や光受容体などの分子研究が取り組まれました。
