EVの詳細な特性評価は困難な場合があり、個々のパラメータを記述するために複数の機器が必要になります。ナノフローサイトメトリーのような単一の技術でこれらの重要な基準を測定すると、複数のEV亜集団が同時に記述されます。したがって、各EVは、蛍光を決定する前に、直径14ナノメートルを超える粒子をラベルフリーで識別して個別に測定されます。
これにより、誤検知を排除することで堅牢なデータセットを作成できます。ナノフローサイトメトリーは、血漿、CSF、培地から濃縮されたものなど、さまざまなソースからEVに適用できます。この技術は、ウイルス、脂質ナノ粒子、およびナノ材料の分析にも使用されます。
ラベル付けプロトコルを最適化することが重要です。これにより、バッファーに残っている残留蛍光と比較して、粒子に関連する蛍光が最大化されます。開始するには、機器の電源を入れ、ナノフロープロフェッショナルをロードして、[シースフロー]ドロップダウンメニューから[スタートアップ]を選択し、ローディングベイに水をロードし、[シースフロー]ドロップダウンメニューから[ブースト]を選択します。
QCビーズを0.6マイクロリットルのチューブ内の蒸留水で1〜100に希釈し、ローディングベイに入れてサンプルをシステムに導入します。次に、前に示したようにサンプルを45秒間ブーストして、前のサンプル、水、または洗浄液を完全に置き換えます。ブースト中に、QCビーズのプリセットテンプレートへのレーザー出力を250ナノメートルFLQC標準に設定します。
後でシステム圧力を下げるには、同じドロップダウンメニューからサンプリング圧力を選択し、自動サンプリング圧力を1キロパスカルに設定して一定の圧力を維持します。次に、集録コントロールから[記録までの時間]を選択して、1分間の分析を開始します。データは、側方散乱強度の対数スケール、および選択された蛍光強度を示すドットプロット上にプロットされます。
ファイルを保存する前に、ファイル名とサンプル希釈液を挿入してください。次に、アンロードを選択して、ローディングベイからチューブを取り外します。QCビーズを150マイクロリットルの洗浄液と交換し、[ブースト]を選択して30秒以上洗浄します。
150マイクロリットルの水を入れたチューブを使用して、キャピラリーチップを水に浸して、キャピラリーチップから余分な洗浄液を取り除きます。次に、サイズ標準ビーズを水で1〜100に希釈し、100マイクロリットルをローディングベイにロードします。次に、レーザー出力をプリセットテンプレートであるS16 EXO 68〜155ナノメートルに設定します。
この設定は、サイズ標準と 200 ナノメートル未満の EV を含むサンプルの両方に適用されます。サンプリングを選択し、サンプルを1分間記録します。水またはPBSサンプルのいずれかを使用して3回目の測定を実行し、ブランク測定値下げを作成し、ソフトウェアによる除去のために誤検知を特定します。
nFCM分析のために、非標識EVサンプルをPBSで1ミリリットルあたり10〜8〜5倍の10〜8番目の粒子の適切な粒子濃度範囲に希釈します。そして、10〜100マイクロリットルの希釈サンプルをローディングベイにロードします。粒子濃度が不明な場合は、EVサンプルを1〜100に希釈することから始めます。
サンプル濃度は、ブースト中のCCDカメラのレーザースポットのサイズ、またはサンプリング中のイベントバーストトレースの観察によって迅速に近似できます。ロードされたサンプルが45秒間ブーストされたら、1分間記録し、前に示したようにファイルを保存します。記録後、このデータの分析を開始し、[取得]タブから[分析]タブに切り替えて、保存したNFAファイルを開きます。
正確なサンプル測定を行うには、サンプリング測定の前に行われた2つの標準測定値を使用して、サンプル比較の値とブランクを設定します。サイズ標準ファイルを選択し、[しきい値の設定]ツールを使用して、側面散布図から直径への変換のサイズ標準曲線を作成します。イベントバーストトレースに表示されるしきい値は、イベントが有意と見なされるために必要な最小信号強度を識別します。
しきい値を設定したら、ドットプロットパラメータ、X軸のSS-HまたはSS-A、Y軸のFITC-Aを確認します。[標準曲線生成]ツールを開き、サイズ設定テンプレートとしてS16 EXO 68〜155ナノメートルを選択します。[Find Peaks] をクリックして、ピーク側の散乱強度を直径 68、91、113、または 155 ナノメートルの粒子として特定します。
ウィンドウを閉じる前に、直径に散乱した辺の曲線が1に近いR値で生成されているかどうかを確認してください。濃度基準を設定します。保存したファイルを選択し、カウント標準をクリックして、標準の粒子濃度を入力します。
標準情報を設定します。EV サンプル ファイルを選択し、しきい値を設定します。空のファイルを選択し、[空白に設定]をクリックして、サンプル数から削除する誤検知の数を特定します。
PDF生成ツールを開いたら、サンプルのサイズ、濃度、希釈を確認します。次に、サンプルの濃度と粒子のサイズ分布を示します。原稿に記載されているようにEVサンプルを標識した後、標識サンプルを1マイクロリットル取り、0.6ミリリットルのチューブでPBSで1〜50に希釈します。
サンプルをローディングベイにロードし、45秒間ブースト圧力をかけます。また、正しいレーザー設定と適切なレンズがロードされていることを確認してください。次に、サンプリング圧力に切り替えて、記録する時間を選択します。
1分間の集録後、データファイルに名前を付けて保存します。サンプルをアンロードし、洗浄液と交換し、洗浄液を30秒以上ブーストしてから、前述のように次のラベル付きサンプルをロードします。PDF の生成には、前に示したのと同じ標準を適用します。
空白の測定値のみが異なって設定されます。サンプル ファイルを選択し、しきい値を設定します。ゲーティングツールを選択し、左クリックして蛍光陽性集団を区切る線を引きます。
リプレゼンテーションの名前と色を設定します。空のファイルを設定し、[空白に設定]をクリックして、異なる母集団ごとに削除する誤検知の数を特定します。PDF 生成ツールを開き、蛍光陽性亜集団のサイズ分布、濃度、およびパーセンテージを特定します。
ドットプロットで、Y軸を変更して、緑または赤のチャンネルからの蛍光測定値を表示します。空白を設定し、前述のように PDF を生成します。ドットプロットで、X軸をFITCに、Y軸をAPCに設定します。
象限ツールを使用して、二重蛍光陽性集団を特定します。名前と色を代表的になるように設定し、PDFファイルを開いて蛍光亜集団を選択します。C2C12由来のEVは、約50%のCD9、30%のCD63の提示を示し、70%の集団が3つのEVマーカーのうちの少なくとも1つを提示した。
単一のテトラスパニン標識EV亜集団のサイズプロファイルは、全粒子集団と比較して、約75〜85ナノメートルの大きな中央値サイズと65ナノメートル未満のEVを示しました。SW620由来のEVは、約40%のCD9、7%のCD63の提示、および42%の粒子が3つのマーカーの少なくとも1つを有することを示した。SW620由来のテトラスパニン標識EVは、より正規分布と90〜110ナノメートルの大きな中央径を示し、個々のテトラスパニン陽性亜集団間で同様の分布を示しました。
膜標識は、C2C12およびSW620由来のEVの80%の陽性性を繰り返し示しました。側方散乱強度は、C2C12とSW620の両方のドットプロット上のFITC強度と相関していました。二重陽性の割合は、テトラスパニン陽性の割合と非常によく似ています。
そして、CD63標識はメンブレン標識と最も弱い相関を示すようです。陽性率の測定は、追加のメンブレン標識の有無にかかわらず抗体標識の間で類似していた。C2C12由来のEVの蛍光集団の平均蛍光強度は、CD9 EVと比較してCD63およびCD81の提示が低いことを示唆したが、SW620は、3つの抗体すべてを使用することが個々の抗体標識よりも大きな蛍光シグナルを提供することを示した。 このプロトコルでは、一般的なEVマーカーが蛍光標識されていますが、抗体標的の多くはEV起源を示すように選択することができます。 EV機能、または病状。
