この方法は、遺伝的多様性パネルまたは育種集団内で利用可能な非光化学的消光における遺伝的変異についての洞察を提供することができる。この技術の主な利点は、1日以内に非光化学的消光の変動について多数の遺伝子型をスクリーニングする可能性である。このプロトコルは、グリシンマックスまたは大豆について提示されていますが、リフトディスクを収集できる他の植物空間を分析するために適合させることができます。
初めてプロトコルを実行する人にとって、鍵となるのは、損傷や水によるスポンジの過飽和を防ぐためにリフトディスクを処理することです。開始するために、発芽後30日目に畑のサイトで植物をサンプリングする。24ウェルプレートのすべてのウェルに1/3レベルの蒸留水を充填します。
蓋とプレートの側面に、サンプリングする反復物のラベルを付けます。植物の上部にある最年少の全膨張葉をゴム栓に当てます。数2のフンボルトコルクボーラーを葉を通して押し、中肋骨を避けてディスクを切るためにねじります。
技術的な複製のために、同じ葉から5枚のディスクを連続して収集します。綿棒を使用して、コルクボーラーから葉のディスクを24ウェルプレートの単一のウェルに押し出し、同じ遺伝子型の別の植物に対してこれを繰り返します。すべてのリーフディスクが水に浮かんでいることを確認します。
そうでない場合は、井戸の側面にくっついている葉のディスクを綿棒で浮かせた位置に静かに動かします。次のプロットからサンプリングディスクに進みます。蓋をし、半透明の可撓性フィルムでシールします。
サンプリングを完了した後、24ウェルプレート全体。プレートを直射日光の当たらない場所で袋、箱、または空のクーラーに保管してください。清潔な実験室スペースで、密封プレートの蓋をタップして、輸送中に蓋に貼り付けられたリーフディスクを外します。
フィルムをほどき、蓋を外します。リーフディスクを24ウェルプレートの最初の位置から、リーフディスクがウェルの底で平らに下を向いた状態で新鮮な96ウェルプレートに移します。鼻吸引フィルターを半分に切る。
得られたフィルターを半分水に浸し、ペーパータオルを軽くたたいて余分な液体を取り除きます。湿度を維持するために、リーフディスクでフィルターを井戸に挿入します。24ウェルプレートの最初の位置から2番目のリーフディスクを取り出し、96ウェルプレートの次に利用可能な位置に下向きに置きます。
生成された鼻フィルターの残りの半分を水に浸し、ペーパータオルに軽くたたいてから、2枚目のリーフディスクで井戸に挿入します。右上隅をテープで留めて、暗闇の中でプレートの向きを合わせてイメージングできるようにします。半透明の可撓性フィルムでプレートをシールし、アルミニウム箔で包みます。
アルミ箔にプロットIDとプレートIDを書き込みます。非光化学的消光の最初の2つの段階を緩和するために、プレートを暗い箱またはキャビネットに最低30分間置きます。非光化学的消光の長期相が興味深い場合は、イメージングの前に1時間の長期暗インキュベーション期間を使用してください。
新しい96ウェルプレートの各隅にリーフディスクを置き、中央に1枚ずつ配置して、分析中に焦点を合わせるための追加のダミープレートを準備します。以前のプレートと同様に、葉のディスクを鼻フィルターで固定し、プレートを密封し、室温および相対湿度50%の暗所でインキュベートします。イメージャーの電源を入れ、イメージングソフトウェアを開きます。
[設定]をクリックしてから[プロトコル]をクリックして、PAM実験プロトコルのステップを入力するためのウィンドウを開きます。原稿で提供されている機械の技術仕様を設定します。飽和パルスで開始するようにプログラムを設定し、After という遅延のボックスに 20 秒を入力して暗に適応した光合成の最大量子効率を測定します。
「パルスを適用」ボックスをクリックし、「この回数」というタイトルのボックスに「1」と入力します。パルスPPFDを6、152、パルス長を800ミリ秒に設定し、すべてのパルスでFプライムとFMプライム画像を取るボックスにチェックを入れます。[後に挿入] をオンにして、プロトコルに 2 番目のステップを追加します。
「遅延の後」というタイトルのボックスに「30 秒」と入力します。次に、[アクチニックの変更] オプションを選択し、[アクチニック PPFD] というタイトルのボックスに「50」と入力して、チャンバーの光強度を 50 PPFD に設定します。[後に挿入] をクリックしてプロトコルに新しいステップを追加し、[遅延の後] というタイトルのボックスに「150 秒」と入力します。
[パルスの適用] を選択し、[この回数] というタイトルのボックスに「4」と入力して、活性光が 50 PPFD に保持されている間に 150 秒ごとに測定パルスを 4 回連続して印加します。原稿に示されている値に従って各ステップの遅延と光強度を調整してから、プロトコルをPCLファイルとして目的の場所に保存します。ライトをオフにし、ダミープレートをサンプルステージに裏返して、葉のアキシャル面が検出器に向かって上向きになり、スポンジがプラットフォームに向かって下を向くようにします。
サンプルステージの高さは、リーフディスクが機器のベースから140ミリメートル上になるように設定します。イメージャーカメラとハードウェアカメラへの接続/切断アイコンをクリックして、カメラを起動します。ベースに緑色の 2 本の線が付いた赤色の両面矢印アイコンで表されるフォーカス蛍光シンボルをクリックし、レンズと露出を調整してプレートに焦点を合わせます。
フォーカス蛍光アイコンをもう一度クリックして、点滅するライトをオフにします。暗闇の中で作業する場合は、ダミー プレートを分析対象のプレートと交換します。右上隅の向きに使用したテープを外側にして裏返しに置き、地図画像カメラアイコンをクリックします。
ポップアップウィンドウのバーがグリーンゾーンに配置されるまで絞りを開閉して、画像の露出を調整します。絞りを調整するたびに、露出が正しく調整され、機器が画像を撮影するまで、再試行ボタンをクリックします。画像を右クリックし、[画像分離の適用]を選択して背景信号をブロックします。
フォーカスされたリーフ領域は灰色で、背景は青で表示されます。画像を右クリックして、[画像の変更]プルダウンメニューからヒストグラムとガンマレベルを調整して、リーフディスクのみを含める領域またはピクセルを選択します。画像を右クリックし、[ハイカットとローカットを削除]を選択して、水色で強調表示された領域を削除します。
画像を右クリックし、[ストレイの削除]を選択して、最後の3つの他のピクセルに触れていないピクセルを削除します。孤立した島として表示される画像上の領域は、個別に分析され、最終的なデータ出力に含まれます。プロトコルの実行アイコンをクリックして、プログラムを起動します。
タイマーが画面の下部に表示され、プロトコルの実行時間が経過したことを通知します。プロトコルが終了するまで待ちます。[ファイルと名前を付けて保存] をクリックして、データを igr ファイルとして保存します。
ウィンドウの右上にある赤い十字をクリックしてウィンドウを閉じてから、別のサンプルプレートを開始します。クロロフィル蛍光データをエクスポートするには、イメージングソフトウェアでigrファイルを開き、[ファイル]をクリックしてから[フォルダにエクスポート]をクリックして、必要なすべてのファイルを含む新しいフォルダを作成します。畑で栽培された大豆における非光化学的消光の典型的な測定は、葉のディスクが毎秒1メートルあたり50マイクロモルの低光にさらされたときにFv/Fmを決定するための最初の飽和フラッシュの後、非光化学的消光は1未満であったことを示した。
さらに、毎秒1メートルあたり2,000マイクロモルの高光に移すと、非光化学的消光は15分後に最大値の4まで増加した。失敗した測定は、高光への転送時の非光化学的消光の最小の増加を示した。イメージャー内のプレートの向きと、リーフディスクのサンプリングとメッキの明確に定義された計画は、データが正しい遺伝子型にリンクされていることを確認するために不可欠です。
このプロトコルは、干ばつや脱落などの環境変数が非光化学的消光に及ぼす影響を定量化したり、異なるキャノピーレベルで非光化学的急冷を評価して作物モデルを改良することができます。
