この作業はウェルカム・トラストSIA賞100329 / Z / 12 / ZからWAHへの支援とHKに授与されたDFGフェローシップKH 376 / 1-1

このプロトコールは、ケンブリッジ大学の動物保護ガイドラインに従う。 1.動物のメンテナンス<ol><li> カエルの胚 注：胚は、動物および実験施設によって飼育および維持することができます。ここでは、動物の維持管理の例を説明します。 <ol><li> 0.88mMのNaCl、10μMのKCl、24μMのNaHCO 3、100μMのHEPES、8.2μMのMgSO4,3.3μMのCa（NO 3 ） 2 、および4.1μMのCaCl 2 （pH7.6）を含む0.1x修飾バース溶液（MBS）溶液を調製する。 。 </li><li> 体外受精によりアフリカツメガエルの胚を得る。 <ol><li>産卵前に妊娠牝血清の性腺刺激ホルモンを1週間（60 IU）および12時間（500 IU）注射して、成体の女性アフリカツメガエル（ Xenopus laevis）で排卵を誘導する。 </li><li>ホモジナイズした男性精巣で卵母細胞を採取し、in vitroで受精させる。 </li><li>ライ16〜18℃で0.1x MBS中の胚を播種した。 Xenopus laevis 14の正常表に従って胚を準備する 。実験のために全体の生きている胚を選択することに注意してください。 </li></ol></li></ol></li><li> ゼブラフィッシュ胚 注：胚は、動物および実験施設によって飼育および維持することができます。ここでは、動物の維持管理の例を説明します。 <ol><li>胚培地：5mM NaCl、0.17mM KCl、0.33mM CaCl 2、0.33mM MgSO 4および0.00001％メチレンブルーを調製する。 </li><li> 26.5℃でWT AB株Danio rerioを維持し、繁殖させる。 </li><li>受精の朝に胚を収集し、上記のように調製した胚培地で28℃で4日間の受精後（dpf）まで飼育し、先に記載したように選択して飼育する15 。 </li></ol></li></ol> インビボでの低酸素の誘発</p&gt; <ol><li> ガスインキュベーションチャンバーの構築 <ol><li>低酸素室の建設のために魚施設で通常使用される繁殖用水槽（ 図1A ）を使用する。このタンクは24穴プレートに適合している必要があります。 </li><li> 図1に示すように、メッシュボトム24ウェルプレートを準備する。この目的のためにフライス盤を使用して、 例えば 24ウェルプレート（ 図1B ）のプラスチック底面を取り外す。 </li><li>ウェルのプラスチックとプレートの壁との間の空間にエポキシ樹脂を充填する。メッシュ径0.1〜0.2mmのナイロンフィルター（ 図1C ）を樹脂被覆プラスチックに取り付け、プレートを完全に乾燥させます。 </li><li>乾燥したら、長さ10mm、直径5mmのトンネルを3本または4本（ 図1D ）、樹脂およびメッシュでコーティングしたプレートの壁面に掘ります。プラスチック製またはテフロン製ロッドを取り付ける適切な直径および30mmの長さのトンネル（ 図1E ）をトンネルに入れ、選択したタンクにプレートを置きます。 </li><li>メッシュ底24ウェルプレートを選択した水槽に置きます。シリコーンチューブ（ 図1F ）を使用して、適切なガスレギュレータ（I）（BOC 200）を使用して、所望のO 2 / N 2混合物または選択された別のガス混合物をガスタンク（ 図1G ）バー）。ここで紹介する低酸素実験では、5％の酸素と95％のN 2の混合ガスを含むガスタンクを使用します。 </li><li>チャンバ媒体の酸素流量を毎秒0.0017-0.0019立方メートルに調整する。このガス流速下では、培地の擾乱はプレートのウェルには見られない。 <ol><li>この目的のために高純度二段ガスレギュレータを使用してください。レギュレータを設定して内圧を下げるeガスタンク（1000~2500PSI）を、実験を通して、10psiの送達圧力に調整した。従って、このガス調整器の仕様によれば、実験を通じて0.00189立方メートル/秒の流量が達成された。 </li></ol></li><li>シリコーンチューブとディストリビューターバルブを水槽内のセラミックディスクディフューザ（ 図1J ）に接続します。水槽を閉め、シリコングリース（ 図1K ）を塗って蓋を慎重に閉めます（ 図1と比較してください）。特定の室温以外の温度が必要な場合は、必要な温度の実験室インキュベーターに低酸素チャンバーを置きます。 </li><li>実験で使用された胚のタイプに応じて、低酸素チャンバータンクに適切な胚培地を充填し、セラミックディスクディフューザを通してガス混合物を拡散させ始める。 10-15分平衡化する。 </li><li> thと平衡化した後所望の酸素混合物を測定し、オキシメーターまたは酸素プローブを用いて水中の酸素濃度を測定する。ここでは、この目的のために光ファイバーに酸素と温度センサーを溶存させたオキシメーターを使用します。 </li></ol></li><li> 胚における低酸素の誘導 <ol><li>慎重に実験のための胚を選択し、低酸素インキュベーションのために全体と生きている胚を使用してください。ここでは、ステージ38のカエルまたはゼブラフィッシュの胚4 dpfをここに示した実験でカエルします。 </li><li>ガスインキュベーションチャンバーを含むインキュベーター（ 図1K ）に胚の皿を置き、インキュベーターの温度に平衡させます。 </li><li>慎重に、プラスチックピペットを使用して、ガスインキュベーションチャンバーのメッシュの24ウェルプレート（ 図1B ）のウェルに胚を移す。プロトコール全体を通して、常に胚移植のためにプラスチックピペットを使用してください。 注：このプレートの各ウェルには、ステージ38の5匹のカエル胚または4dpfの7ゼブラフィッシュ胚まで。異なる遺伝子型を使用する場合は、ウェルに慎重にラベルを付けます。 </li><li>ガスインキュベーションチャンバーは、5時間または実験に合った長い時間、選択した混合ガスを用いて一定の注入を維持する。ここで5％O 2と95％N 2の混合物を使用してください。 </li><li>胚をガスインキュベーションチャンバーから胚型に対応する酸素正常培地に注意深く移し、直ちにステップ3または4に進む。 </li><li>さらに正常酸素処理が必要な場合は、胚を胚の種類に対応する酸素正常培地に注意深く移す。 </li></ol></li></ol> 3. HIF-1αレベルのモニタリングによる低酸素誘導の制御<ol><li> 準備 <ol><li> 0.1x MBS中の0.4mg / mL MS222溶液を調製する。 </li><li>ホモジナイズバッファーの調製：ラジオイムノ沈降アッセイバッファー（RIPA buffer）を使用し、プロテアーゼインヒビターでの実験に必要な緩衝液の量を最終濃度1：100 v / vに補う。 </li><li>ウエスタンブロットのための溶液を調製する。 <ol><li> 425mMトリスpH8.0,40％v / vグリセロール、8％v / v SDS、4％v / vベータメルカプトエタノール、0.5％w / vブロモフェノールブルー、10mL総容量ddH 2 O. </li><li>ランニングバッファー5倍を調製する：トリズマ塩基15g、グリシン72g、SDS5g、総容量1dH 2 O。 </li><li>トランスファーバッファーの調製：トリスア塩基2.66g、グリシン14.4g、100％メタノール200mL、総容量1dH 2 O。 </li><li> 10×TBST：5mL 1MトリスpH8.0,30mL 5M NaCl、2.5mLツイーン20,1L全容量H 2 Oを調製する。 </li><li>ブロッキング溶液：4％w / v脱脂粉乳を1x TBSTで調製する。 </li></ol></li></ol></li><li> 組織の収集 <ol><li> 0.4mg / mLのMS222溶液で入浴することにより胚を麻酔するプラスチックピペットを用いてホモジナイゼーションバッファーを充填したプラスチック反応管に移す。胚あたり20μLのバッファーを使用してください。 HIF1αタンパク質レベルの有意な変化を決定するためには、ステージ38の少なくとも5匹のカエル胚または4dpfの7ゼブラフィッシュ胚が必要であることに留意されたい。 </li><li>適切な組織ホモジナイザーまたは超音波処理装置を使用して組織を均質化する。遠心分離（15分; 13,000×g; 4℃）により残渣を除去する。 <ol><li>あるいは、麻酔したカエル胚17から網膜を切開し、上記のようにホモジナイズする。 10個の網膜ごとに20μLのホモジナイゼーションバッファーを使用する。 </li></ol></li><li>ピペットを用いて上清を取り、85℃で5分間変性させ、Laemmliゲルローディングバッファーを補充して1x v / vの最終濃度にします（ 例えば 、15μLのホモジネートに4倍のLaemmliバッファーを5μL添加する）。 Wesにこの上清を使用する-20℃でサンプルをブロットまたは凍結する。 </li></ol></li><li> ウエスタンブロット <ol><li>ステップ3.2に記載のように調製した試料を、1x v / v泳動緩衝液を用いた電気泳動システム中のプレキャスト12％ゲルにロードする。タンパク質サイズ測定にはタンパク質ラダーを使用します。 1時間、トランスファーバッファー中のニトロセルロースメンブレン（0.45μm膜）にタンパク質を移し、4℃で氷上でパックします。 </li><li>ブロッキング緩衝液中で膜を60分間インキュベートする非特異的結合部位をブロックする。 1x TBSTで3回、10分間洗浄する。 </li><li>ウサギ抗HIF-1α抗体およびマウス抗α-チューブリンの1：100v / vおよび1：5000v / vに希釈した溶液中の膜を、ブロッキング溶液中、室温で2.5時間インキュベートする。 1x TBSTで3回、10分間洗浄する。 </li><li>検出のために、ブロッキング溶液中で1：1000v / vに希釈したヤギ抗ウサギおよびヤギ抗マウスHRP結合抗体を1時間インキュベートする。1×TBSTで3×10分の洗浄を行い、市販のキットおよび選択した現像機を使用してHRP染色を視覚化する。 </li><li>デジタル定量化を用いてHIF1αタンパク質の量を定量する。 </li></ol></li></ol> 4.低酸素状態における細胞増殖のモニタリング<ol><li> 準備 <ol><li>選択した胚培地で5 mM EDU溶液を調製する。この溶液は直ちに使用するか、またはアリコートに分けて-20℃で6ヶ月間保存することができます。 </li><li>リン酸緩衝食塩水（PBS）を調製するか、PBSを商業的資源から購入する。 115℃で10分間オートクレーブする。 </li><li> EdUの組み込みの検出のための解決策を準備する。 <ol><li>固定溶液：PBS中の16％ホルムアルデヒドストック溶液4％v / vを調製する。 </li><li>スクロース溶液：PBS中30％w / vスクロースを調製する。 </li><li> PBST：PBS中の0.1％v / v Triton X-100を調製する。 </li><li>ブロッキング溶液の調製：10％v / v熱不活性化ヤギ血清（HIGS）をPBSTに入れた。 </li><li> DAPI溶液：PBST中の1：1000v / v 4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を調製する。 </li></ol></li></ol></li><li> EdU取り込みのための低酸素状態における胚の培養 <ol><li>ガスインキュベーションチャンバーに、1％v / v DMSOを補充した5mM EdU溶液400〜500mLを充填する。実験の15分前に、実験で使用したのと同じガス混合物で溶液を予め平衡化する。インキュベーション溶液の体積は、より短いロッド（ 図1E ）をメッシュ底プレートに取り付けることによって最小限に抑えることができることに留意されたい。 </li><li> 5％O 2と95％N 2の混合ガスを含むガスボンベにガス配管を接続します。溶液を15分間インキュベートする。 </li><li>胚を低酸素チャンバーに移し、それらをウェルの間に均等に分配し、2時間インキュベートする。各ウェルは、ステージ38の5匹のカエル胚または7ゼブラフィッシュ胚4 dpfまで適合することができる。 </li><li>胚を分析するEdUの設立について</li></ol></li><li> 低酸素症およびEdU取り込みにおける胚インキュベーションの時間経過 <ol><li>ガスインキュベーションチャンバーを、選択した胚培地500mLで満たす。 5％O 2と95％N 2の混合ガスを含むガスボンベにガス配管を接続し、15分間混合物で媒体を平衡化する。 </li><li>胚を低酸素チャンバーに移し、それらをウェル間に均等に分配し、48時間まで所望の時間インキュベートする。最後の1時間、1％v / v DMSOを補充した5mM EdU溶液で胚培地を置換する。 </li><li>胚を酸素正常な皿に戻し、EdUの取り込みを分析する。 </li></ol></li><li> EdU組込みの検出と分析 <ol><li> 0.4 mg / mLのMS222溶液で入浴することにより胚を麻酔する。 </li><li>胚を適切なガラスバイアルに移し、固定溶液中で2ヘクタールt RTまたは4℃でO / N。 PBSで3回洗浄してください。組織の凍結保護のために胚を慎重にスクロース溶液に移す。胚がガラスバイアルの底に沈むまで、または4時間インキュベートする。 </li><li>埋め込み培地（最適切断温度化合物）に胚を埋め込む。凍結切片は直ちに胚をブロックするか、-80℃で最大14日間保存する。 </li><li>クライオスタットを用いて胚を含むブロックを凍結切除する。顕微鏡スライド上に12μm（ゼブラフィッシュ胚）または16μm（カエル胚）の切片を集め、乾燥させる。即座に凍結切片を処理するか、-20℃で最大3ヶ月間保存する。 </li><li>市販の化学キットを使用して免疫蛍光染色によりEdU取り込みを検出する。製造元の指示に従って、実験における凍結切片の数に必要な量のEdU反応混合物を調製する。 <ol><li> 500μLのEdU反応混合物に対して、430μLの1X EdU反応緩衝液、20μLのCuSO 4、1.2μLのAlexa Fluorアジド、50μLの1×EdU緩衝液添加剤。 </li></ol></li><li> cryosectionsを一度PBSで洗浄して包埋培地を除去し、PBSTで3×5分洗浄して組織を透過させる。ブロッキング溶液中の凍結切片を30分間インキュベートする。 </li><li>凍結切片をEdU反応混合物と共に1時間インキュベートし、続いてPBST中で3×10分間洗浄する。凍結切片をDAPI溶液で15分間維持し、続いてPBST中で3×10分間洗浄する。スライドガラスを染色した凍結切片でマウント培地に載せ、カバーガラスで覆い、乾燥させてから蛍光顕微鏡下で分析するか、または4℃で最大1年間保存する。 </li><li>凍結切片を倒立共焦点走査顕微鏡下で抗EdU染色で分析し、デジタル定量化を用いてEdU陽性細胞の数を決定する。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-altitude+physiology+and+pathophysiology:+implications+and+relevance+for+intensive+care+medicine.">High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine.</a> Crit Care. 11 (1), 203 (2007).</li><li>Grant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+level+and+acute+responses+to+hypoxia:+do+they+predict+physiological+responses+and+acute+mountain+sickness+at+altitude?.">Sea level and acute responses to hypoxia: do they predict physiological responses and acute mountain sickness at altitude?.</a> Brit J Sport Med. 36 (2), 141-146 (2002).</li><li>Kajimura, S., Aida, K., Duan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+growth+factor-binding+protein-1+(IGFBP-1)+mediates+hypoxia-induced+embryonic+growth+and+developmental+retardation.">Insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1) mediates hypoxia-induced embryonic growth and developmental retardation.</a> PNAS. 102 (4), 1240-1245 (2005).</li><li>Ong, K. K., Dunger, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinatal+growth+failure:+the+road+to+obesity,+insulin+resistance+and+cardiovascular+disease+in+adults.">Perinatal growth failure: the road to obesity, insulin resistance and cardiovascular disease in adults.</a> Best Pact Res Clin Endocrinol Metab. 16, 191-207 (2002).</li><li>Maxwell, P., Salnikow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1:+an+oxygen+and+metal+responsive+transcription+factor.">HIF-1: an oxygen and metal responsive transcription factor.</a> Cancer Bio Ther. 3 (1), 29-35 (2004).</li><li>Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., Wang, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+genes+encoding+glycolytic+enzymes+by+hypoxia-inducible+factor+1.">Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1.</a> J Biol Chem. 269 (38), 23757-23763 (1994).</li><li>Yuan, Y., Hilliard, G., Ferguson, T., Millhorn, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cobalt+inhibits+the+interaction+between+hypoxia-inducible+factor-alpha+and+von+Hippel-Lindau+protein+by+direct+binding+to+hypoxia-inducible+factor-alpha.">Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha.</a> J Biol Chem. 278 (18), 15911-15916 (2003).</li><li>Elks, P., Renshaw, S. A., Meijer, A. H., Walmsley, S. R., van Eeden, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+HIFs,+buts+and+maybes+of+hypoxia+signalling+in+disease:+lessons+from+zebrafish+models.">Exploring the HIFs, buts and maybes of hypoxia signalling in disease: lessons from zebrafish models.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8, 1349-1360 (2015).</li><li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-mimetic+agents+desferrioxamine+and+cobalt+chloride+induce+leukemic+cell+apoptosis+through+different+hypoxia-inducible+factor-1alpha+independent+mechanisms.">Hypoxia-mimetic agents desferrioxamine and cobalt chloride induce leukemic cell apoptosis through different hypoxia-inducible factor-1alpha independent mechanisms.</a> Apoptosis. 11 (1), 67-77 (2006).</li><li>Woods, I. G., Imam, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+severe+hypoxic+stress+during+development+in+zebrafish.">Transcriptome analysis of severe hypoxic stress during development in zebrafish.</a> Genom Data. 6, 83-88 (2015).</li><li>Rouhi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+metastasis+model+in+embryonic+zebrafish.">Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish.</a> Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).</li><li>Stevenson, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+disruption+of+vertebrate+CAN+pathfinding+through+EphrinB2+is+rescued+by+magnesium.">Hypoxia disruption of vertebrate CAN pathfinding through EphrinB2 is rescued by magnesium.</a> PLoS Genet. 8 (4), e1002638 (2012).</li><li>Khaliullina, H., Love, N. K., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient-Deprived+Retinal+Progenitors+Proliferate+in+Response+to+Hypoxia:+Interaction+of+the+HIF-1+and+mTOR+Pathway.">Nutrient-Deprived Retinal Progenitors Proliferate in Response to Hypoxia: Interaction of the HIF-1 and mTOR Pathway.</a> J Dev Biol. 4 (2), (2016).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J., Nieuwkoop, D. P., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kohn, D. F., Wixson, S. K., White, W. J., Benson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , (1997).</li><li>McDonough, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection,+Culture,+and+Analysis+of+Xenopus+laevis+Embryonic+Retinal+Tissue.">Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue.</a> JoVE. (70), (2012).</li></ol>

著者らは競合する金銭的利益がないと宣言している。

ここでは、カエルやゼブラフィッシュの胚に使用するために調整された低酸素を誘発する簡単ではあるが堅牢な新しい方法を紹介しましたが、他の水生生物にも適しています。この方法の大きな利点は、その単純さとコスト効率にあります。それにもかかわらず、この方法で達成される結果は非常に頑強である。本発明者らは、全胚および特定の組織（ここでは網膜）において、低酸素がチ?...

低酸素症の研究には多くの用途があります。これらには、低酸素症1および急性高病気2を特徴とする病状の病因の調査および治療の開発が含まれる2 。低酸素ストレスは、酸素を必要とする全ての生物において主要な代謝変化を引き起こす。低酸素ストレスは、子宮内発育制限を含むいくつかのヒト疾患の胎児の成長および発育および病因にも影響する3 。低酸素ストレスは、出生時体重、胎児および新生児死亡率の低下につながるだけでなく、心血管疾患、2型糖尿病、肥満および高血圧のような成人においても多くの合併症を引き起こす可能性があります4 。低酸素ストレスは、腫瘍組織がその血液供給を超えて増殖する固形腫瘍発生の間にしばしば観察される。したがって、インビボでの低酸素症の影響を直接的に調べることが重要である<html>ヨニック開発。 発生中の低酸素の影響を研究するために用いられてきた最もよく知られている方法の中には、増殖培地中での塩化コバルトの使用または低酸素室での生物のインキュベーションがある。塩化コバルトは、低酸素誘導性因子-1アルファ（HIF-1α）のプロテオソーム分解を防止することによる安定化の役割のために、通常の酸素濃度下で人工的に低酸素応答を誘導する5,6,7。しかしながら、簡便な方法8であることから、塩化コバルトおよび他の同様の化学的低酸素擬態物の使用は、細胞および組織、 例えばアポトーシス9に非特異的有害な効果を有し得る。したがって、低酸素室は、正常な発達過程を経て、生体内の「自然低酸素症」を誘導するより良い方法です。 ntent &quot;&gt;水生動物胚の低酸素誘導系の開発に注力してきたカエルとゼブラフィッシュの両方は、様々な生物学的過程の研究のための有益な脊椎動物モデル生物であり、様々なヒト疾患のモデルでもあります。母体の補償の合併症を排除し、外的に発達させ、母親の補償の合併症を排除することができます。また、早期開発により、環境因子を操作し、臓器形成における表現型の変化をリアルタイムで観察することができます。カエルとゼブラフィッシュの胚を用いて脊椎動物の発生に及ぼす低酸素の影響を研究することの主な利点は、酸素が迅速に胚に浸透するため、すべてのプロセスを直接監視することができることです。したがって、カエルおよびゼブラフィッシュでは、他のモデル生物とは対照的に、機能的脈管構造の存在または欠如を考慮することなく、目的の組織において特異的酸素濃度の影響を研究することができる。 低酸素インキュベーションのための市販されているほとんどのセットアップは、比較的に大きく、それに対応して高いランニングコストを有するという欠点を有する。それらの初期初期費用およびガス消費量が高いことを除けば、一般的な低酸素症室の平衡および維持は、より大きなサイズおよび/または生物呼吸のためにこれらの室で自然に生じるガス勾配に対して一定の低酸素雰囲気の維持を必要とする。これにはガスファンと冷却装置の使用が必要となり、設備の追加が増え、研究者の手間がかかりにくくなり、実験手順が単純になります。対照的に、ここに示す設定は、比較的堅牢ですが、非常に費用対効果が高く、小さく、確立しやすく、f安定した低酸素雰囲気およびチャンバ内の材料および溶液の簡単な交換を可能にする。我々のシステムは、関心のある任意の水生生物に使用することができます。 私たちは、好都合に小さく、従って任意の特定の温度で実験手順を容易に可能にする共通の実験室インキュベータ内に置くことができる低酸素室を構築した。培地中の酸素濃度と同様に温度の便利な制御を提供することにより、市販の低酸素インキュベーターに対する我々のシステムの利点は、小型でコスト効率にある。したがって、大部分の研究室で利用可能な一般的な研究室用品を使用して設定することができ、高価な材料を必要としません。さらに、市販の低酸素インキュベーターとは異なり、我々のセットアップでは熱が発生せず、インキュベーターに入れた室温より低い温度での使用が可能です。ラ発生および代謝速度が温度に大きく依存するカエルおよび魚のような冷血生物の研究にとって特に重要である。 それにもかかわらず、当社のガスインキュベーションチャンバーは、非常に費用対効果が高く簡単に構築できるため、様々な低酸素状態または高酸素状態を確立する上で非常に用途が広く、膨大な数の実験条件に対して様々な培地および溶液を迅速かつ容易に投与できます。さらに、一般的に使用される皿または実験室用タンク10,11,12の代わりに24ウェルプレートを使用することにより、本発明者らのシステムはいくつかの変異体条件の観察および実験的処理を一度に可能にする。 低酸素症の正確な誘導を制御するために、我々はウエスタンブロット検出によってHIF-1αタンパク質のレベルをモニターした。さらに、インキュベーション前後の増殖細胞の数nは、低酸素症が組織に誘導されているかどうかを判定するために使用することができる。この方法は、胚性網膜幹細胞ニッチにおける増殖が低酸素症の誘発時に減少することを示す以前に発表された結果13に基づいている。したがって、本発明者らは、5-エチニル-2&#39;-デオキシウリジン（EdU）を胚培地に添加し、新たに増殖する細胞のDNAへの取り込みを測定することによって、網膜幹細胞増殖のレベルをモニターした。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td style="width:167px;">NaCl / 0.1X MBS, Embryo medium, 10X TBST</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9333</td>
			<td style="width:167px;">KCl / 0.1X MBS, Embryo mediu,</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5761</td>
			<td style="width:167px;">NaHCO3 / 0.1X MBS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3375</td>
			<td style="width:167px;">0.1X MBS</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7506</td>
			<td style="width:167px;">MgSO4 / 0.1X MBS, Embryo medium</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Calcium nitrate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">202967</td>
			<td style="width:167px;">Ca (NO3)2 / 0.1X MBS</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1016</td>
			<td style="width:167px;">CaCl2 / 0.1X MBS, Embryo medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Methylene blue</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M9140</td>
			<td style="width:167px;">Embryo medium</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Pregnant mare serum gonadotropin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CG10</td>
			<td style="width:167px;">frog fertilization</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Zebrafish breeding tank</td>
			<td style="width:71px;">Carolina</td>
			<td style="width:119px;">161937</td>
			<td style="width:167px;">gas chamber construction</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">24-well plate</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">142475</td>
			<td style="width:167px;">Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Epoxy resin</td>
			<td style="width:71px;">RS Components UK</td>
			<td style="width:119px;">Kit 199-1468</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Gas distributor valve</td>
			<td style="width:71px;">WPI Luer Valves</td>
			<td style="width:119px;">Kit 14011</td>
			<td style="width:167px;">aquatic tank attachment (Schema 1, H)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">High precision gas valve</td>
			<td style="width:71px;">BOC&#160;</td>
			<td style="width:119px;">200 bar HiQ C106X/2B</td>
			<td style="width:167px;">gas tank attachment (Schema 1, I)</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">5% oxygen and 95% N2 gas tank</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:119px;">226686-L</td>
			<td style="width:167px;">hypoxic gas mixture</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">ceramic disc diffuser</td>
			<td style="width:71px;">CO2 Art&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005</td>
			<td style="width:167px;">Schema 1, J</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">silicone grease</td>
			<td style="width:71px;">Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td style="width:119px;">VAC1100</td>
			<td style="width:167px;">Schema 1, K</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">oxymeter</td>
			<td style="width:71px;">Oxford Optronix&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Oxylite, CP/022/001</td>
			<td style="width:167px;">hypoxic chamber setup</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">fibre-optic dissolved oxygen sensor</td>
			<td style="width:71px;">Oxford Optronix</td>
			<td style="width:119px;">HL_BF/OT/E</td>
			<td style="width:167px;">hypoxic chamber setup</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">plastic pasteur pipette</td>
			<td style="width:71px;">Sterilin</td>
			<td>STS3855604D</td>
			<td style="width:167px;">for embryo transfer</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">MS222&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E10521-50G</td>
			<td style="width:167px;">embryo anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">RIPA buffer&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R0278-50ML</td>
			<td style="width:167px;">tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Protease inhibitor</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td style="width:167px;">tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">77-86-1</td>
			<td style="width:167px;">4X Laemmli loading buffer, 10X TBST</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G5516</td>
			<td style="width:167px;">4X Laemmli loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L3771</td>
			<td style="width:167px;">SDS, 4X Laemmli loading buffer, 5X Running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">beta-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M6250</td>
			<td style="width:167px;">4X Laemmli loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Bromophenol Blue</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B0126</td>
			<td style="width:167px;">4X Laemmli loading buffer</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Trizma base&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">77-86-1</td>
			<td style="width:167px;">5X Running buffer, Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8898</td>
			<td style="width:167px;">5X Running buffer, Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">34860</td>
			<td style="width:167px;">Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P2287-500ML</td>
			<td style="width:167px;">10X TBST</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">skim milk powder</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>70166</td>
			<td style="width:167px;">Blocking Solution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Eppendorf microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>T9661</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">tissue homogenizer</td>
			<td style="width:71px;">Pellet Pestle Motor Kontes</td>
			<td style="width:119px;">Z359971</td>
			<td style="width:167px;">tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">pellet pestles</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z359947-100EA</td>
			<td style="width:167px;">tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">precast 12% gel</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Biorad</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">Mini-ProteinTGX, 456-1043</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">protein ladder</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Amersham</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">Full-Range Rainbow ladder, RPN800E</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">nitrocellulose membrane (0.45 &#181;m)</td>
			<td style="width:71px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">162-0115</td>
			<td style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">anti-HIF-1&#945; antibody</td>
			<td style="width:71px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab2185</td>
			<td style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">anti-&#945;-tubulin antibody</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6074</td>
			<td style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">goat anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:71px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab6789</td>
			<td style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">goat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:71px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97080</td>
			<td style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Pierce ECL 2 reagent&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">80196</td>
			<td style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:216px;">ECL films Hyperfilm</td>
			<td style="width:71px;">GE Healthcare Amersham</td>
			<td style="width:119px;">28906837</td>
			<td style="width:167px;">Western Blot</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">5-Ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine &#160;</td>
			<td style="width:71px;">santa cruz</td>
			<td style="width:119px;">CAS&#160;61135-33-9</td>
			<td style="width:167px;">EdU, EdU incorporation</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Phosphate-buffered Saline</td>
			<td style="width:71px;">Oxoid</td>
			<td style="width:119px;">BR0014G</td>
			<td style="width:167px;">1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28908</td>
			<td style="width:167px;">Fixation solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:71px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">S/8600/60</td>
			<td style="width:167px;">Solution solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284-500ML</td>
			<td style="width:167px;">PBST</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Heat-inactivated Goat Serum</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G6767-100ml</td>
			<td style="width:167px;">HIGS, Blocking solution (EdU incorporation)</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole&#160;</td>
			<td style="width:71px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td style="width:167px;">DAPI, EdU incorporation</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">C10338</td>
			<td style="width:167px;">DMSO, EdU incorporation</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">glass vial</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">98178853</td>
			<td style="width:167px;">EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Tissue-Plus optimal cutting temperature compound&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Scigen</td>
			<td style="width:119px;">4563</td>
			<td style="width:167px;">embedding medium, EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">cryostat Jung Fridgocut 2800E</td>
			<td style="width:71px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;">CM3035S</td>
			<td style="width:167px;">EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">microscope slides Super-Frost plus Menzel glass</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">J1800AMNZ</td>
			<td style="width:167px;">EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">EdU Click-iT chemistry kit</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">C10338</td>
			<td style="width:167px;">EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">FluorSave</td>
			<td style="width:71px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">D00170200</td>
			<td style="width:167px;">mounting medium, EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">coverslips</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">ECN631-1575</td>
			<td style="width:167px;">EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">fluorescent microscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Eclipse 80i</td>
			<td style="width:167px;">EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">confocal scanning microscope</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">Fluoview FV1000</td>
			<td style="width:167px;">EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Volocity software</td>
			<td style="width:71px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">Volocity 6.3</td>
			<td style="width:167px;">EdU incorporation analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of hypoxia in living frog and zebrafish embryos

ここでは、カエルやゼブラフィッシュの胚などの水生生物における低酸素の影響を研究するために開発した低酸素誘導のための新しいシステムを紹介します。私たちのシステムは、簡単なセットアップを特長とするチャンバーで構成されていますが、実験ソリューションの中で特定の酸素濃度と温度を誘導し維持するには堅牢です。提示されたシステムは非常に費用対効果が高いが、高度に機能的であり、インビボおよび48時間までの様々な期間の直接的実験のための低酸素の誘導および持続を可能にする。 低酸素症の影響をモニターし、研究するために、全胚または特定の組織における低酸素誘導因子1アルファ（HIF-1α）のレベルの測定、および5-エチニル-2&#39;-デオキシウリジンによる網膜幹細胞増殖の測定、デオキシウリジン（EdU）をDNAに組み込む。 HIF-1αレベルは、全胚または組織中の一般的な低酸素症マーカーとして働くことができるここでは胚性網膜です。胚性網膜の増殖細胞へのEdU取り込みは、低酸素誘導の特異的産物である。したがって、我々は、低酸素胚性網膜前駆細胞が、カエルおよびゼブラフィッシュの両方の胚の5％酸素下でのインキュベーションの1時間以内に増殖を減少させることを示した。 習得したら、私たちの設定は、小さな水生生物、直接的なインビボ実験、任意の所与の期間、正常、低酸素または高酸素酸素濃度下で、または任意の他の所定のガス混合物で使用することができる。

ここに示す低酸素チャンバーシステムを採用することで、生きている動物全体で 、低酸素の影響を個々に、そしてインビボで調べることができます。低酸素症は、低酸素室（ 図1 ）にカエルまたはゼブラフィッシュの胚全体を置くことによって誘導することができ、異なる条件の組み合わせで行うことができます。完成したガスチ...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos at JoVE.com

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

我々は、カエルやゼブラフィッシュの胚などの水生生物に使用するための新しい低酸素チャンバーシステムを紹介します。私たちのシステムはシンプルで頑丈で、費用効果が高く、インビボで48時間まで低酸素症の誘導と持続が可能です。低酸素症の有効性をモニターする2つの再現可能な方法を提示する。

生きた蛙およびゼブラフィッシュの胚における低酸素の誘導

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

induction-of-hypoxia-in-living-frog-and-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.7K ビュー.  University of Cambridge. 我々は、カエルやゼブラフィッシュの胚などの水生生物に使用するための新しい低酸素チャンバーシステムを紹介します。私たちのシステムはシンプルで頑丈で、費用効果が高く、インビボで48時間まで低酸素症の誘導と持続が可能です。低酸素症の有効性をモニターする2つの再現可能な方法を提示する。 

ビデオ: Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

光変換後の蛍光減衰を使用して生活ゼブラフィッシュ胚におけるタンパク質の安定性の測定（FDAP）

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

発生生物学

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

ゼブラフィッシュ胚における機械的血管損傷

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-&#946; receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate 125I-TGF-&#946;2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

ゼブラフィッシュ胚からの内因性受容体の親和性ラベリング検出

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

生きたゼブラフィッシュ胚における運動ニューロン膜電位のバイオセンシング

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

光シートベースの蛍光生活の顕微鏡または固定し、染色<em&gt;モドキTribolium castaneum</em&gt;胚

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫賦形化学

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...