このプロトコルでは、マイクロ流体チップをベースにした連続フローポリメラーゼ連鎖システムを構築する方法と、ラボでキャピラリー電気泳動システムを構築する方法について説明します。これは、ラボで核酸を分析するための簡単な方法を提供します。ポリメラーゼ連鎖反応は、標的遺伝子の増幅に用いられる伝統的な方法です。
しかし、従来のPCRは温度変化効率が低いため、非常に時間がかかります。本研究は、マイクロ流体チップをベースとした連続フローPCRシステムを提案している。増幅時間は、異なる温度に設定されたヒーターに配置されたマイクロチャネルにPCR溶液を流すことで大幅に短縮できます。
CEは、高分解能、高速、優れた再現性など、多くの利点があるため、核酸やタンパク質の分析のためのラボで人気のあるツールになりました。しかし、ほとんどのラボ、特に発展途上国のラボでは、CE機器の価格が高いため、この技術を購入する余裕がありません。ここでは、CF-PCRマイクロ流体チップの製造方法と、ラボで汎用性の高いCEシステムを構築する方法のプロトコルを概説しました。
また、CF-PCRシステムによる大腸菌の増幅プロセスと、CEシステムによるPCR産物の検出についても説明します。このプロトコルに記載されている手順に従うことで、ユーザーはマイクロ流体チップを製造し、PCR溶液を調製し、核酸増幅用のCF-PCRシステムを構築し、限られたリソースでもDNA断片を分離するための単純なCEシステムをセットアップできるはずです。シリコンウェーハを摂氏200度で25分間加熱して水分を取り除きます。
ウェーハの1インチあたり1ミリリットルのSU-8 2075フォトレジストをディスペンスします。スピンコーターを使用してシリコンウェーハ上でスピンコーターを使用して、毎秒100rpmの加速度で5〜10秒間、次に2, 000rpmで毎秒500rpmの加速度で30秒間スピンします。65°Cで3分、95°Cで15分ソフト焼きます。
フォトリソグラフィ装置の露光エネルギーを150〜215ミリジュール/平方センチメートルに設定し、フォトリソグラフィマスクでフォトレジストにデザインしたパターンを彫刻します。シリコンウェーハとマスクを露光の準備を整えます。露光後、ウェーハを65°Cで2分間、95°Cで7分間焼きます。
シリコンウェーハを現像液に浸漬して余分なフォトレジストを除去し、マイクロ流路が見えたら取り出します。次に、イソプロパノールを使用して、残留現像液を洗い流します。ポリジメチルシロキサンプレポリマーと硬化剤を10対1の割合で混合します。
混合したPDMS溶液をレプリカ型に流し込み、80°Cで60分間固化させます。PDMSマイクロ流体チップは、プラズマクリーナーで活性化後、スライド上に貼り合わせ、できるだけ早く80°Cで30分間固化させます。ボルテックスミキサーと遠心分離機を使用して、試薬が十分に混合されていることを確認します。
遠心チューブを準備します。まず、遠心分離管に水を加えます。次に、DNAテンプレート、プライマー、バッファー、dNTP混合物、Tween 20、PVPを添加し、最後にDNAポリメラーゼを添加します。
最後に、溶液を渦で混合します。PTCセラミックヒーター2個、ソリッドステートリレー2個、温度コントローラー2個、温度センサー2個、電源コードを用意します。ヒーターをソリッドステートリレーに接続します。
ソリッドステートリレーをPID温度コントローラに接続します。次に、温度センサープローブを2つのヒーターの下部に取り付け、端子をPID温度コントローラーに接続します。最後に、2つのソリッドステートリレーを直列に接続し、電源コードを接続します。
2つのヒーター用のスロットを3Dプリントし、ヒーターを同じ平面に保ちます。マイクロ流体チップを2つのヒーターに置きます。シリンジポンプとシリンジを用意し、シリンジポンプにシリンジを固定します。
シリコーンチューブをシリンジで接続し、シリコーンチューブの上部にスチールニードルを接続します。スチールニードルをマイクロ流体チップの入口に挿入します。チップの出口にピペットチップを置き、PCR産物を回収します。
高電圧電源を使用して、パルス電界電界を生成します。ほら、これは高圧電源です。これらは正極と負極です。
水銀ランプを光源として使用し、水銀ランプからの励起波長をフィルターでフィルタリングします。キャピラリーを顕微鏡ステージに置きます。蛍光発光を対物レンズで捕集し、光電子増倍管で検出します。
これが私たちの顕微鏡で、これが私たちのキャピラリーです。次に、暗い部屋の条件下でライトをオンにします。励起光は対物レンズによって収集されます。
自社開発のLABVIEWソフトウェアを使用して電源を制御し、データ集録を完了します。CF-PCRシステムのヒーターの温度を65°Cと95°Cにプリセットします。マイクロ流体チップを2つの加熱ブロックの上に置きます。
シリコンチューブの先端を50マイクロリットルのPCR溶液が入った遠心分離チューブに挿入します。シリンジプランジャーを引いて、溶液をゆっくりと引き出します。シリンジをシリンジポンプに固定します。
スチールニードルをマイクロ流体チップの入口に挿入します。ポンプの流量を毎分10マイクロリットルに設定し、スタートボタンを押して、マイクロチップの入口にあるマイクロチャネルに溶液を押し込みます。マイクロ流体チップの出口でPCR産物を回収します。
全長8センチ、有効長6センチのキャピラリーを用意します。100マイクロリットルの1%HEC、2マイクロリットルの100x SYBR Green、および98マイクロリットルの超純水を混合して分離バッファーを調製し、1x SYBR Greenを含む0.5%HECを得ます。 真空ポンプを使用して、調製した分離バッファーをキャピラリーに充填します。
ソフトウェアインターフェースで注入電圧と注入時間を入力し、スタートボタンをクリックして、PCR産物がキャピラリーに電気力学的に導入されるのを待ちます。ソフトウェアインターフェースにDC電圧を入力し、スタートボタンをクリックして、100ボルト/センチメートルの電界強度で電気泳動を実行します。すべてのDNA断片がキャピラリーで分離されたら、停止ボタンをクリックします。
各実行後、キャピラリーを滅菌水で1分間洗い流します。この写真は、PCR産物とDNAマーカーのエレクトロフェログラムを表しています。まず、CF-PCRシステムで大腸菌の標的遺伝子を増幅し、チップの入口から出口まで約10分30秒でPCR溶液を導きました。
大腸菌の標的アンプリコンのサイズは544bpであった。その後、増幅したPCR産物をキャピラリー電気泳動システムで分析しました。また、100 bpのDNAラダーのキャピラリー電気泳動も同様の実験条件で行いました。
PCR産物のサイズは、DNAラダーのエレクトロフェログラムに従って評価できます。各実験は再現性のために3回行った。この写真のデータは、分離後に大腸菌のPCR産物に対応するピークが観察され、マイクロ流体チップ内のPCR産物の移動時間がサーマルサイクラーのものと一致していることを示しています。
PCRとCEはどちらも、核酸の分析において人気のある2つのバイオテクノロジーです。この論文では、自社で構築したCF-PCRおよびCEシステムを使用した大腸菌の増幅とPCR産物の検出について説明します。大腸菌の標的遺伝子は10分以内に増幅され、1, 500 bp未満のDNA断片は8分以内に分離されました。
また、本研究で紹介したマイクロ流体チップをベースとしたCF-PCRシステムやCEシステムは、作製が容易であり、実験室での核酸分析を簡便に行うことができる可能性があります。一度に1つのサンプルしか増幅して検出できないため、幅広い用途が制限されます。そのため、病原体をハイスループットで検出するためのCF-PCRとCEマイクロ流体チップアレイの統合開発はまだ進行中です。
