この方法により、研究者は、従来の経験的実験アプローチの必要性を最小限に抑えながら、目的の細胞タイプに最適なエレクトロポレーションパルス条件を決定することができます。この方法は、マイクロエレクトロポレーション技術を利用して、エレクトロポレーションプロセス全体を通して細胞膜透過の程度を電気的に監視することができるスケーラブルなマイクロ流体作動デバイスを製造する。手順を実演するのは、私の研究室の修士課程の学生であるキシャンクマールブシャです。
まず、スピンコーターの真空システムを使用して、シリコンウェーハをウェーハスピンコーターのチャックに固定します。次に、スピナーをプログラムします。次に、シリコンウェーハの中央に4ミリリットルのSU-8 2010フォトレジストを塗布し、プログラムを実行します。
システムが停止したら、掃除機をオフにします。次に、2Dマイクロ流体チャネル設計のフォトマスクをマスクホルダーに固定し、SU-8コーティングを上向きにしてシリコンウェーハをウェーハチャックに挿入します。露出設定を150ミリジュール/平方センチメートルに設定し、機械を稼働させます。
UV露光後、シリコンウェーハをSU-8現像液に浸し、3〜4分間穏やかに攪拌します。次に、溶液からウェーハを取り出し、イソプロパノールで表面をすすぎます。次に、シリコンウェーハを摂氏150度のオーブンに30分間入れてハードベイクします。
次に、スタイラス形状測定を使用してチャネル側壁の正確な高さと傾斜を測定する前に、室温まで冷却します。次に、スライドガラスの表面に1ミリリットルのフォトレジストを塗布し、プログラムをもう一度実行します。システムが停止したら、掃除機をオフにしてスライドガラスを取り外します。
2D電極設計のフォトマスクをマスクホルダーに固定した後、S-1818コーティングを上向きにしてガラスウェーハを挿入し、ウェーハチャックに位置合わせします。露出設定を215ミリジュール/平方センチメートルに設定し、機械を稼働させます。露光後、スライドガラスをMF-319現像液に2分間沈め、穏やかに撹拌した。
次に、ガラスウェーハを取り外し、その表面を脱イオン水ですすいでください。最後に、スライドガラスを摂氏150度のオーブンに入れてハードベイクし、目的の基板の表面が上を向いていることを確認します。30分後、スライドをオーブンから取り出し、光から保護します。
スライドガラスをエッチングするには、10対1緩衝フッ化水素酸溶液に1分間、ポリテトラフルオロエチレン容器に沈めます。次に、スライドガラスを脱イオン水で3回移して洗浄します。次に、物理蒸着システムを用いて、チタンを毎分100オングストロームの速度で8分間スパッタし、白金を毎分200オングストロームで10分間スパッタした。
次に、フォトレジストを持ち上げるために、金属コーティングされたスライドガラスをアセトン浴に10分間沈め、浴を超音波処理して攪拌を導入する。必要に応じて、アセトンを浸したワイプを使用して残留物を取り除きます。次に、ポリジメチルシロキサンのレプリカ成形では、電子天秤の上に置かれた使い捨て容器に10対1の重量比で硬化剤を備えたPDMSエラストマーベースを作成します。
次に、PDMS溶液をシリコンウェーハ上に注ぎ、混合物を真空下に置いて気泡を除去します。65°Cで最低4時間硬化させた後、カミソリの刃先で成形したPDMSを切り取り、シリコンウェーハから剥がします。次に、鋭利な生検パンチを使用して、デバイスの入口と出口からPDMSを取り外します。
次に、プラズマ発生器をPDMSボンディング用にプログラムします。次に、PDMSと電極ガラススライドをフィーチャーを上に向けてシステムに配置し、プログラムを実行します。プログラムが完了したら、デバイスを取り外し、ステレオスコープを使用して、チャネル機能を電極にすばやく位置合わせします。
PDMSの中心から側面に向かってしっかりと圧力をかけ、ボンディング界面の不要な気泡を取り除きます。HEK293細胞を回収して遠心分離し、ペレットをミリリットルあたり約500万細胞のエレクトロポレーションバッファーに再懸濁します。次に、GFPをコードする血漿DNAをミリリットル当たり20マイクログラムの最終濃度まで加え、穏やかに混合する。
次に、実験のために血漿-DNA細胞懸濁液を1立方センチメートルの注射器に移します。スライドホルダーを介してマイクロデバイスを顕微鏡のステージに置きます。次に、充電された結合デバイスであるCCDカメラの電源を入れ、マイクロ流体チャネルに焦点を合わせます。
次に、シングルセルエレクトロポレーションの場合、シリンジポンプの流量を毎分0.1〜0.3マイクロリットルに設定して、電極セットを通るシングルセルの流れを確保します。次に、初期および最小の電気エネルギーエレクトロポレーションパルスのパルスパラメータを設定します。パルスアプリケーションごとに所定の数の細胞検出に従います。
テストされた各条件の最後に、マイクロデバイスのコンセントから細胞を吸引し、コンセントに回収培地を補充します。次のエレクトロポレーションパルス条件まで反復し、すべてのエレクトロポレーションパルス条件がテストされるまで繰り返します。次に、高スループットポピュレーションベースのフィードバックのためのエレクトロポレーションパルスパラメータを決定します。
ポピュレーションベースのフィードバック制御エレクトロポレーションでは、シリンジポンプの流量を毎分1〜3マイクロリットルに設定し、パルス振幅を最適な条件に設定します。次に、トリガーモードをオフにして、セルの通過時間に一致するようにパルス幅を設定します。所望の数の細胞がエレクトロポレーションされたら、シリンジポンプとファンクションジェネレーターの両方をオフにします。
次に、細胞を出口リザーバーから、予め温めた回収培地で満たされた適切なサイズの細胞培養フラスコまたはプレートに移し、培養フラスコまたはプレートをインキュベーターに移します。データ解析では、データを解析ソフトウェアにロードし、各パルス条件の電流対時間のプロットを生成します。次に、細胞膜透過の程度を決定し、テストされたすべてのパルス条件で細胞膜透過マップを生成し、最適なパルス条件を検証します。
インキュベーション後、FITCと遠赤色フィルターを使用して落射蛍光画像をキャプチャし、手動またはアルゴリズムを介して画像セットを分析します。ここでは、単一パルス振幅の単一細胞レベルの透過処理検出の背後にある動作原理を強調しています。各エレクトロポレーションパルスパラメータの後に、次に高いエネルギーのエレクトロポレーションパルスがテストされます。
HEK293細胞の細胞膜透過マップは、印加された電気エネルギーと細胞膜透過の程度との間に明確な相関を示した。この実験では、1.8キロボルト/センチメートルの電界強度と670マイクロ秒のパルスが最適であると決定されました。これらの値では、70%のエレクトロトランスフェクション効率が達成されました。
0.4キロボルト/センチメートルの電界強度と3ミリ秒のパルス持続時間とは対照的に、24時間での電気トランスフェクション効率は5%未満でしたマイクロファブリケーションプロセスの特定の説明時によく使用されるレシピという用語は、機能するデバイスを正常に製造するために各ステップに従うか最適化することの重要性を挿入します。このエレクトロポレーション技術は、CAR T細胞の生成とテスト、CRISPR-Cas9遺伝子編集技術の最適化とテストなど、追加の生物医学研究プロジェクトに利用できます。このマイクロエレクトロポレーション技術により、さまざまな細胞タイプの応答を電気的に調べて電気パルス条件を適用し、その情報を臨床的に関連する分子貨物の送達に関連付けることができます。
