生体内 再現性を促進するためのマウス網膜における血管損傷の読み出し

このプロトコルにより、ユーザーはマウス網膜イメージングにおける損傷の臨床的に類似したマーカーを定量的に測定することができ、その後の所見の翻訳可能性を強化します。これらの方法により、解析を合理化し、実験動物間のイメージングを確実に比較することができます。これらの方法は、マウスモデルの概要を研究するために開発されましたが、同じイメージング技術を使用する網膜疾患の研究に簡単に拡張できます。

網膜イメージング顕微鏡ライトボックス、光干渉断層撮影機、および加熱されたマウスプラットフォームの電源を入れます。コンピュータの電源を入れ、イメージングプログラムを開きます。各目にフェニレフリンとトロピカミドを1滴加えます。

100マイクロリットルの1%フルオレセインを腹腔内に注射する。プラットフォームにマウスを合わせます。網膜眼底の視界が明確で焦点が合うまで、プラットフォームの高さと角度を調整します。

眼底の写真を撮ります。イメージングおよび光干渉断層撮影ソフトウェアを開きます。光干渉断層撮影プログラムで、微調整を10に調整します。

光コヒーレンストモグラフィー画像を撮影し、火傷から遠位に75マイクロメートルを追加します。網膜の他の3つの象限についても繰り返します。カメラを488ナノメートルのフィルターに切り替えます。

カメラゲインを5に増やします。フルオレセイン注射のちょうど5分後に眼底の写真を撮ります。画像処理ソフトウェアでフルオレセイン画像を開きます。

画像を複製します。選択ツールを使用して、主要な血管を注意深くトレースします。これらの船舶から分岐している船舶は無視してください。

最初の画像では、選択範囲を削除し、船舶のみを残します。このマスクされた画像を保存します。選択範囲を2番目の画像に移動し、選択範囲を反転して削除し、背景を分離します。

このマスクされた画像を保存します。背景画像を開き、積分密度を測定します。血管画像を開き、血管の輪郭を選択して、平均強度を測定します。

背景の積分密度を血管の平均強度で割り、眼の漏れ率を生成します。実験コホートの各眼のこの漏れ率を記録します。バックグラウンドをさらに制御するには、実験眼を無傷の対照眼の平均漏出率に正規化します。

画像処理ソフトウェアで光干渉断層撮影画像を開きます。神経節細胞層、内網状層、内顆粒層、外網状層、感光体層、RPE層の境界をトレースします。ファイルを CSV としてエクスポートします。

各層の平均厚さを測定し、実験コホートの各眼について繰り返します。画像J.ラインツールを使用して、外側の網状層の上部境界が不明瞭になる距離を測定します。混乱が始まる緯度を維持しながら、水平方向に測定します。

画像内の無秩序な距離の合計を計算します。解体の長さを網膜の全長で割って、解体の比率を求めます。網膜の他の3つの象限からの光干渉断層撮影画像の測定と計算を繰り返します。

4つの光干渉断層撮影画像から解体の比率の平均を取ります。この数値は、網膜全体の平均的な混乱を表します。実験コホートの各眼について繰り返します。

各網膜画像の漏出率の計算に使用されるマスクされた画像は、他の画像と比較して分析することができ、網膜の他の領域から主要な血管系を分離することができる。フルオレセイン定量により、傷害の重症度と治療効果の比較、および損傷の経時変化にわたる漏れの変化の研究が可能になります。OCT画像における網膜の層の描写が観察される。

各網膜層の厚さの定量化は、最初の浮腫反応が網膜内部層に対してより深刻な影響を与えることを示しています。網膜静脈閉塞損傷の経時変化の解析から、網膜層の初期炎症性腫脹、および最終的な変性菲薄化を観察することができる。内顆粒層は最初の損傷に対してはるかに大きな反応を経験しますが、最初の浮腫が安定してベースラインに戻った後、内叢状層はより重度の菲薄化を示します。

網膜内層の混乱は、外網状層の上部境界の消失として現れ、外網状層と内顆粒層を一緒にブレンドする。網膜損傷の軽減における阻害剤の有効性を調べるために、2つの実験群の網膜解体を比較した。画質は分析品質にとって非常に重要です。

網膜画像を取得するときは、眼底層と網膜層ができるだけ鮮明で焦点が合っていることを確認するために時間をかけてください。これらの非侵襲的方法は、縦断的に、および組織の生化学的および免疫組織化学的研究と組み合わせて使用 して、疾患のより多面的で詳細なプロファイルを作成することができます。この技術により、神経血管疾患のモデルにおけるin vivo網膜イメージングデータの信頼性の高い定量が可能になり、データをヒトの疾患により容易に変換できるようになります。