Name: in vivo multimodal imaging and analysis of mouse laser-induced choroidal neovascularization model
Uploaded: 2018-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
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著者感謝したい Yuliya Naumchuk (Loyola 大学シカゴ)、アグネ Žiniauskaitė (Experimentica 株式会社) 優れた技術と再生産のサポート。カジャ博士の研究プログラムをサポートするには、博士ジョン p. とテレーズ E. マルケイ恵まれて教授ロヨラ大学シカゴ校で眼科で。

すべての動物は、動物のための使用の眼科とビジョンの研究や、EC 指令 86/609/EEC 動物実験で承認され、フィンランドの動物実験委員会によって監視されているプロトコルを使用して ARVO 声明に従って扱われました。
1. レーザー マウス CNV モデル5
<ol><li>肉眼的に異常動物の目を検査します。</li>
	<li>マウスの重量を量る。</li>
	<li>計算し、動物、例えばメデトミジン (1 mg/kg), ケタミン (75 mg/kg)、および 1:1.5:2.5、またはケタミン (40-75 mg/kg) の割合で蒸留水 (0.9 %nacl 溶液) の混合物の重量に基づいて、使用する麻酔薬の適切な量を準備します。キシラジン (5 mg/kg)、および 1:2.; 5:1 の割合で蒸留水 (0.9 %nacl 水溶液)20 g のマウスのための混合物の 0.1 mL を注入します。</li>
	<li>腹腔内麻酔薬を注入します。</li>
	<li>動物に麻酔がかかるまでは、ケージと待機にマウスを置きます。マウスは正しくペダル反射の欠如によって麻酔を確認します。</li>
	<li>レーザー安全保護具の使用を確認します。</li>
	<li>スリッ トランプと 532 nm ダイオード レーザーを入れます。</li>
	<li>ケージや加熱パッド上の場所から、マウスを削除します。</li>
	<li>瞳孔の拡張のトロピカミドの一滴を適用します。フル (3 mm) 瞳孔の拡張のための 3-5 分を待ちます。</li>
	<li>スリッ トランプのステージ上にマウスを置きます。</li>
	<li>Applanate 角膜に coverslip の眼科液体ゲルの一滴を配置します。</li>
	<li>中心部で視神経乳頭とマウスの目を向けます。</li>
	<li>レーザー パワーを 100 にセット mW、100 ms に期間および 50 μ m スポット サイズ。</li>
	<li>レーザー光線を網膜色素上皮 (RPE) に焦点します。</li>
	<li>1 つ目にそれぞれ理想的で、4、8、および 12 ポジション、視神経乳頭周囲の網膜の血管を避けることによって 3 つのレーザー ショットを確認します。すべてレーザー網膜出血の不在のためのショット後の眼底を検査します。反対側の眼は非レーザ書込みコントロールとして機能します。</li>
	<li>加熱パッド背面 coverslip と場所のマウスを破棄します。</li>
	<li>両方の目に釘ゲルの滴の一滴を適用します。</li>
</ol>2. SD 10 月6,7
<ol><li>齧歯動物のアライメント ステージにマウスを置き、頭を固定します。</li>
	<li>X ・ Y ステージ コント ローラーを用いた生体内イメージングの目に直面する (例えばBioptigen/ライカ Envisu R2200) SD 10 月システムのレンズを合わせます。</li>
	<li>SD 10 月ブルッフ膜の中断を確認するスキャンを実行: 書込みサイトで基準線を手動で移動 SD-10 月は、全体の目をスキャンしたら。ブルッフ膜の区切りは、書込み領域 (図 1参照) で明確に見えるはずです。</li>
</ol>3. フルオレセイン造影7,8,9
<ol><li>ホルダー、マウスを取り外して、FA システム (例えば、ハイデルベルク Spectralis HRA2) の上に置きます。</li>
	<li>レーザーで焦点は、表示ウィンドウの中央に視神経の頭部と赤外モードを使用しての眼底部を燃やします。</li>
	<li>皮下や腹腔内 5% フルオレセイン ナトリウム塩 20 g のマウスのための 0.1 mL を注入します。</li>
	<li>脈絡膜レベルに焦点を当てます。</li>
	<li>脈絡膜のフォーカス レベルからイメージを取る。</li>
	<li>網膜のレベルを合わせるし、イメージを取る。</li>
	<li>30 s と繰り返し手順 3.4 3.6 を待ちます。</li>
	<li>マウスをホルダーから外し、加熱パッドの上に置きます。</li>
	<li>メデトミジン、アチパメゾール (0.5 mg/kg, i. p.)、または麻酔から動物の回復を待つのため α 2 拮抗薬による麻酔を逆にします。</li>
	<li> SD-10 月と FA イメージング麻酔下の動物 5、10、および 14 フォロー アップ日を繰り返します。</li>
</ol>4. CNV のグレーディング
<ol><li>グレード 10 月画像、次として 0 日目にレーザー加工後すぐに撮影した脈絡膜の FA 画像からブルッフ膜の損傷: 0 - ブルッフ膜が破損していません。 1 にブルッフ膜の成功した被害</li>
	<li>等級一連の次のように網膜の FA イメージの蛍光信号のダイナミクスを比較することによって観測された漏れがあった書込みのスポットから CNV の存在: 0 - 網膜の正常な外観 漏れの 0.5 - かすかな染 1.0 - 漏れの CNV 領域 注: は、OCT 画像における網膜流体の存在が CNV グレーディングお勧めしたい疑問 FA、CNV の確認を OCT イメージングを使用します。</li>
</ol>5. 網膜厚測定
<ol><li>網膜の厚さ測定の自動領域分割ソフトウェアを使用します。その合計の網膜厚は RPE (健康測定サイト)、または損傷 (書込みサイト) のサイトの周り RPE を結ぶ架空の線神経線維層からのすべての層の厚さとして考慮されることを確認 (図 7を参照)。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dobi, E. T., Puliafito, C. A., Destro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+experimental+choroidal+neovascularization+in+the+rat.">A new model of experimental choroidal neovascularization in the rat.</a> Arch. Ophthalmol. Chic. Ill 1960. 107, 264-269 (1989).</li><li>Tobe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+neovascularization+in+mice+with+overexpression+of+vascular+endothelial+growth+factor+in+photoreceptors.">Evolution of neovascularization in mice with overexpression of vascular endothelial growth factor in photoreceptors.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 180-188 (1998).</li><li>Seo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+inhibition+of+retinal+and+choroidal+neovascularization+by+oral+administration+of+a+kinase+inhibitor.">Dramatic inhibition of retinal and choroidal neovascularization by oral administration of a kinase inhibitor.</a> Am. J. Pathol. 154, 1743-1753 (1999).</li><li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization.">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Prog. Retin. Eye Res. 29, 500-519 (2010).</li><li>Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+for+Laser-induced+Choroidal+Neovascularization.">A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization.</a> J Vis Exp. (106), e53502 (2015).</li><li>Giani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+evaluation+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+using+spectral-domain+optical+coherence+tomography.">In vivo evaluation of laser-induced choroidal neovascularization using spectral-domain optical coherence tomography.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 3880-3887 (2011).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+an+Image-Guided+Laser-Induced+Choroidal+Neovascularization+Model+in+Mice.">Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice.</a> PloS One. 10, e0132643 (2015).</li><li>Sheets, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotectin+D1+attenuates+laser-induced+choroidal+neovascularization+in+mouse.">Neuroprotectin D1 attenuates laser-induced choroidal neovascularization in mouse.</a> Mol. Vis. 16, 320-329 (2010).</li><li>Hoerster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+and+ex-vivo+characterization+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+variability+in+mice.">In-vivo and ex-vivo characterization of laser-induced choroidal neovascularization variability in mice.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. Albrecht Von Graefes Arch. Klin. Exp. Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).</li><li>Sulaiman, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Optical+Coherence+Tomography+Quantification+Method+for+Choroidal+Neovascularization.">A Simple Optical Coherence Tomography Quantification Method for Choroidal Neovascularization.</a> J. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. 31, 447-454 (2015).</li></ol>

著者 Symantas Ragauskas、博士は従業員 (研究員) と提供契約のこの記事で使用されている臨床の CNV モデルを用いた研究サービス Experimentica 会社の株主です。
エヴァ Kielczewski の著者は、この記事で使用される SD OCT システムを生み出すライカマイクロシス テムズの社員 (研究アプリケーション エンジニア、10 月) です。
著者ジョセフ ・ ヴァンスは従業員 (NA 10 月セールス ・ ディレクター) のこの記事で使用される SD OCT システムを生み出すライカマイクロシス テムズ。ジョセフ ・ ヴァンスは、また社長と目的と、LLC のマネージング ディレクターです。
著者サイモン カジャ、博士はコンサルタント最高科学責任者および前臨床契約研究機関提供受託研究サービス、この記事で使用される臨床 CNV モデル税込 Experimentica 株式会社の株主です。サイモン カジャ、博士も CEO の K & P 科学的な LLC は、コンサルティング会社、生命科学、博士ジョン p. とテレーズ E. マルケイ恵まれて教授ロヨラ大学シカゴ、Stritch 医学部眼科として提供しています。この整理の言葉が検討されており、その利益相反ポリシーに従ってロヨラ大学シカゴ校によって承認されました。
著者 Giedrius Kalesnykas 博士は従業員 (CEO) と提供契約のこの記事で使用されている臨床の CNV モデルを用いた研究サービス Experimentica 会社の株主です。

マルチ モーダル イメージングでは、CNV の病理学的評価のための貴重なツールを提供しています。FA から成るイメージング プロトコルの紹介、SD OCT と CNV 病理、再現可能な迅速かつ信頼性の高い評価のための自動セグメンテーション。ブルッフ膜レーザー管理が確認された後の休憩。また、この段階で SD 10 月の使用はまたの結果の解釈を混同するかもしれない可能な網膜と網膜出血の即時?...

齧歯動物で人間の CNV の病理学を模倣する最初の成功した試みはロング ・ ラット1クリプトン レーザーでほぼ三十年前を示した。その後、クリプトン レーザーは、最も人気のあるマウス緊張、c57bl/6 j2,3,4でブルッフ膜を破るに使用されました。FA と組織学的汚れ CNV 誘導の成功率を検証しました。OCT などの非侵襲的画像診断装置の急速な発展は、齧歯動物の前臨床モデルのフィールドの成長を促しています。大幅目と同じで複数の時点で網膜の形態変化を監視する機能は動物の使用の削減に寄与する、実験的研究の効率が向上します。CNV 病変の組織学的評価ではなく簡単で、レーザー管理、画像取得と画像解析ソフトを用いた面積/体積推定のサイトの周りの異常血管の増殖のラベリングを必要とします。対照的に、生体内のイメージ投射様相は、CNV の病理とその解釈のより複雑な分析をご紹介します。
ここで提示グレード誘導、進行、CNV の回帰してシンプルで比較的高速なメソッド FA、SD、OCT を使用して、マウスの自動抽出法レーザー誘起 CNV モデル。

<table><tbody><tr><td>Medetomidine (commercial name Domitor)</td><td>Orion</td><td>Vnr 01 56 02</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Intervet</td><td>Vnr 51 14 85</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>0,9% NaCl</td><td>B Braun</td><td>357 0340</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>Xylazine (commercial name Rompun vet)</td><td>Bayer</td><td>vnr 14 89 99</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>Tropicamide</td><td>Santen</td><td>Vnr 04 12 36</td><td>Mydriatic agent</td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>Alcon</td><td>Vnr 44 54 81</td><td>Lubricant</td></tr><tr><td>Systane</td><td>Alcon</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>Lubricant</td></tr><tr><td>5% Fluorescein sodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6377-100G</td><td>Fluoresent agent</td></tr><tr><td>Atipamezole (commercial name Antisedan)</td><td>Orion</td><td>Vnr 47 19 53</td><td>Anesthesia</td></tr></tbody></table>

in vivo multimodal imaging and analysis of mouse laser-induced choroidal neovascularization model

レーザー誘発脈絡膜新生血管 (CNV) は、加齢に伴う黄斑変性症 (AMD) のウェット フォームを模倣する確立されたモデルです。このプロトコルでは血管新生のプロセス、マルチ モーダル縦から得ることができる強力な情報焦点を当てるをトリガーするレーザー誘起病変を生成の技術的な考察を通して単に読者を目指します生体内のフォロー アップ期間中イメージングします。
レーザー マウス CNV モデルは、ダイオード レーザーの管理によって生成されました。体内のマルチ モーダル イメージング技術は、CNV 誘導、進行と回帰を監視する使用されました。最初、ブルッフ膜の中断を確認するレーザー加工直後後スペクトル領域光干渉断層法 (SD 10 月) を行った。血管造影 (FA) を使用してその後体内イメージング脈絡膜レベルでシリアル画像からブルッフ膜の正常な損傷を確認しました。SD 10 月と FA の両方を使用して CNV の増殖と、レーザー加工後 5、10、および 14 日回帰の縦方向のフォロー アップを行った。シンプルで信頼性の高い FA 画像から漏れの CNV leasions の等級が表示されます。CNV のサイトで網膜の厚さの測定のための手動口径アプリケーションと組み合わせて、合計の網膜厚測定のための自動セグメンテーションは、浮腫の存在の公平な評価を許可します。最後に、脈絡膜の flatmounts に isolectin GS IB4 染色を使って CNV の組織学的検証を行います。どちらられる、染色は、ImageJ で isolectin 正面積が計算されます。
このプロトコルは、CNV の病理学のような高スループット スクリーニングを必要とすることができます高速、マルチ モーダル、治療研究と CNV 病理学および網膜浮腫の信頼性の高い分類に便利です。さらに、高解像度 SD OCT は網膜や網膜の流体の蓄積など、他の病理学的特徴の記録をできます。ただし、このメソッドは SD OCT 画像から手動で行う必要のあるボリュームの CNV 解析を自動化する可能性を行いません。

バブルやレーザー加工後すぐに出血は常に表示されません。したがって、SD 10 月は特にブルッフ膜の損傷を確認することが重要です。図 1は、異なる時点でレーザー投与後 OCT イメージングの例を示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56173/56173fig1.jpg"> 図 1<stro...

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In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

生体内でマルチ モーダル イメージングとマウス レーザー誘発脈絡膜新生血管モデルの解析

マウスのレーザー誘発脈絡膜新生血管の形態学的変化のフォロー アップの縦生体内イメージングの有用性を紹介します。

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

in-vivo-multimodal-imaging-analysis-mouse-laser-induced-choroidal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

9.1K ビュー.  Experimentica Ltd.. マウスのレーザー誘発脈絡膜新生血管の形態学的変化のフォロー アップの縦生体内イメージングの有用性を紹介します。

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A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model of ocular hypertension to mimic human high-tension glaucoma. Here laser illumination is applied to the corneal limbus to photocoagulate the aqueous outflow, inducing angle closure. The changes of IOP are monitored using a rebound tonometer before and after the laser treatment. An optomotor behavioral test is used to measure corresponding changes in visual capacity. The representative result from one mouse which developed sustained IOP elevation after laser illumination is shown. A decreased visual acuity and contrast sensitivity is observed in this ocular hypertensive mouse. Together, our study introduces a valuable model system to investigate neuronal degeneration and the underlying molecular mechanisms in glaucomatous mice.

Chronic ocular hypertension is induced using laser photocoagulation of the trabecular meshwork in mouse eyes. The intraocular pressure (IOP) is elevated for several months after laser treatment. The decrease of visual acuity and contrast sensitivity of experimental animals are monitored using the optomotor test.

ビジュアル欠陥を特徴づけるために慢性高眼圧症のレーザー誘起マウスモデル

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model ...

医学

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, difficulties in observing posterior choroidal melanoma in vivo limit tumor location and growth evaluation in real-time. The approach described here optimizes techniques for establishing choroidal melanoma in mice via a multi-step sub-choroidal B16LS9 cell injection procedure. To enable precision in injecting into the small dimensions of the mouse uvea, the complete procedure is performed under a microscope. First, a conjunctival peritomy is formed in the dorsal-temporal area of the eye. Then, a tract into the sub-choroidal space is created by inserting a needle through the exposed sclera. This is followed by the insertion of a blunt needle into the tract and the injection of melanoma cells into the choroid. Immediately after injection, noninvasive optical coherence tomography (OCT) imaging is utilized to determine tumor location and progress. Retinal detachment is evaluated as a predictor of tumor site and size. The presented method enables the reproducible induction of choroid-localized melanoma in mice and the live imaging of tumor growth evaluation. As such, it provides a valuable tool for studying intraocular tumors.

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

The present protocol describes the implantation and evaluation of melanoma in the murine choroid utilizing optical coherence tomography.

光干渉断層撮影 による マウス脈絡膜への黒色腫の移植と評価

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

がん研究

A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch&#8217;s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD. 
First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects. 
The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.
Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.

Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

レーザ誘起脈絡膜血管新生のためのマウスモデル

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) ...

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. Multiphoton microscopy (MPM) has become one of the most popular imaging modalities for biomedical study at cellular levels in vivo, advantages include high resolution, deep tissue penetration and minimal phototoxicity. We have designed an MPM imaging platform with a customized mouse eye holder and a stereotaxic stage for imaging ocular surface in vivo. Dual fluorescent protein reporter mouse enables visualization of cell nuclei, cell membranes, nerve fibers, and capillaries within the ocular surface. In addition to multiphoton fluorescence signals, acquiring second harmonic generation (SHG) simultaneously allows for the characterization of collagenous stromal architecture. This platform can be employed for intravital imaging with accurate positioning across the entire ocular surface, including cornea and conjunctiva.

Presented here is a multiphoton microscopic platform for live mouse ocular surface imaging. Fluorescent transgenic mouse enables the visualization of cell nuclei, cell membranes, nerve fibers and capillaries within the ocular surface. Non-linear second harmonic generation signals derived from collagenous structures provide label-free imaging for stromal architectures.

マウス角膜と結膜のライブイメージングのためのカスタム多光子顕微鏡プラットフォーム

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...

生物工学

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

生体内でスペクトル領域光干渉断層法と走査レーザー眼底Cx3cr1gfp/gfpレポーター マウスの画像

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. Innate immune cells, specifically mononuclear phagocytes, express overlapping cell surface markers, which makes identifying these populations a challenge. Multi-parameter flow cytometry allows for the simultaneous, quantitative analysis of multiple cell surface markers in order to differentiate monocytes, macrophages, microglia, and dendritic cells in mouse eyes. This protocol describes the enucleation of whole mouse eyes, ocular dissection, digestion into a single cell suspension, and staining of the single cell suspension for myeloid cell markers. Additionally, we explain the proper methods for determining voltages using single color controls and for delineating positive gates using fluorescence minus one controls. The major limitation of multi-parameter flow cytometry is the absence of tissue architecture. This limitation can be overcome by multi-parameter flow cytometry of individual ocular compartments or complimentary immunofluorescence staining. However, immunofluorescence is limited by its lack of quantitative analysis and reduced number of fluorophores on most microscopes. We describe the use of multi-parametric flow cytometry to provide highly quantitative analysis of mononuclear phagocytes in laser-induced choroidal neovascularization. Additionally, multi-parameter flow cytometry can be used for the identification of macrophage subsets, fate mapping, and cell sorting for transcriptomic or proteomic studies.

This protocol provides a method to digest whole eyes into a single cell suspension for the purpose of multi-parameter flow cytometric analysis in order to identify specific ocular mononuclear phagocytic populations, including monocytes, microglia, macrophages, and dendritic cells.

単核食細胞の多パラメータフローサイトメトリック解析のためのマウス全体の眼の消化

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...

免疫・感染学

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

神経科学

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a detailed method pointing out critical steps is provided with recommendations for optimization to achieve consistently successful occlusion rates across different genetically modified mouse strains. The RVO mouse model consists primarily of the intravenous administration of a photosensitizer dye followed by laser photocoagulation using a retinal imaging microscope attached to an ophthalmic guided laser. Three variables were identified as determinants of occlusion consistency. By adjusting the wait time after rose bengal administration and balancing the baseline and experimental laser output, the variability across experiments can be limited and a higher success rate of occlusions achieved. This method can be used to study retinal diseases that are characterized by retinal edema and hypoxic-ischemic injury. Additionally, as this model induces vascular injury, it can also be applied to study the neurovasculature, neuronal death, and inflammation.

Here, we describe an optimized protocol for retinal vein occlusion using rose bengal and a laser-guided retinal imaging microscope system with recommendations to maximize its reproducibility in genetically modified strains.

変動性を制限するための網膜静脈閉塞マウスモデルの最適化

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To properly leverage this greater translatability, there is a need to devise reproducible methods of drawing quantitative data from these images. Optical coherence tomography (OCT) imaging can resolve retinal histology at micrometer resolution and reveal functional differences in vascular blood flow. Here, we delineate noninvasive vascular readouts that we use to characterize pathological damage post vascular insult in an optimized mouse model of retinal vein occlusion (RVO). These readouts include live imaging analysis of retinal morphology, disorganization of retinal inner layers (DRIL) measure of capillary ischemia, and fluorescein angiography measures of retinal edema and vascular density. These techniques correspond directly to those used to examine patients with retinal disease in the clinic. Standardizing these methods enables direct and reproducible comparison of animal models with clinical phenotypes of ophthalmic disease, increasing the translational power of vascular injury models.

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Here, we present three data analysis protocols for fluorescein angiography (FA) and optical coherence tomography (OCT) images in the study of Retinal Vein Occlusion (RVO).

生体内 再現性を促進するためのマウス網膜における血管損傷の読み出し

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for analyzing collateral arteries and leukocytes in arteriogenesis is ex vivo (immuno-) histological methodology. However, this technique does not allow the measurement of dynamic processes such as blood flow, shear stress, cell-cell interactions, and particle velocity. This paper presents a protocol to monitor in vivo processes in growing collateral arteries during arteriogenesis utilizing intravital imaging. The method described here is a reliable tool for dynamics measurement and offers a high-contrast analysis with minimal photo-cytotoxicity, provided by multiphoton excitation microscopy. Prior to analyzing growing collateral arteries, arteriogenesis was induced in the adductor muscle of mice by unilateral ligation of the femoral artery.
After the ligation, the preexisting collateral arteries started to grow due to increased shear stress. Twenty-four hours after surgery, the skin and subcutaneous fat above the collateral arteries were removed, constructing a pocket for further analyses. To visualize blood flow and immune cells during in vivo imaging, CD41-fluorescein isothiocyanate (FITC) (platelets) and CD45-phycoerythrin (PE) (leukocytes) antibodies were injected intravenously (i.v.) via a catheter placed in the tail vein of a mouse. This article introduces intravital multiphoton imaging as an alternative or in vivo complementation to the commonly used static ex vivo (immuno-) histological analyses to study processes relevant for arteriogenesis. In summary, this paper describes a novel and dynamic in vivo method to investigate immune cell trafficking, blood flow, and shear stress in a hindlimb model of arteriogenesis, which enhances evaluation possibilities notably.

The recruitment of leukocytes and platelets constitutes an essential component necessary for the effective growth of collateral arteries during arteriogenesis. Multiphoton microscopy is an efficient tool for tracking cell dynamics with high spatio-temporal resolution in vivo and less photo-toxicity to study leukocyte recruitment and extravasation during arteriogenesis.

マウス後肢モデルにおける動脈形成中の白血球動員モニタリングのための多光子生体内イメージング

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for ...

生体内でマルチモーダルイメージングとマウスレーザー誘発脈絡膜新生血管モデルの解析

要約

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ビジュアル欠陥を特徴づけるために慢性高眼圧症のレーザー誘起マウスモデル

光干渉断層撮影によるマウス脈絡膜への黒色腫の移植と評価

レーザ誘起脈絡膜血管新生のためのマウスモデル

マウス角膜と結膜のライブイメージングのためのカスタム多光子顕微鏡プラットフォーム

生体内でスペクトル領域光干渉断層法と走査レーザー眼底Cx3cr1^gfp/gfpレポーターマウスの画像

単核食細胞の多パラメータフローサイトメトリック解析のためのマウス全体の眼の消化

経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

変動性を制限するための網膜静脈閉塞マウスモデルの最適化

生体内再現性を促進するためのマウス網膜における血管損傷の読み出し

マウス後肢モデルにおける動脈形成中の白血球動員モニタリングのための多光子生体内イメージング

生体内でマルチ モーダル イメージングとマウス レーザー誘発脈絡膜新生血管モデルの解析

要約

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ビジュアル欠陥を特徴づけるために慢性高眼圧症のレーザー誘起マウスモデル

光干渉断層撮影 による マウス脈絡膜への黒色腫の移植と評価

レーザ誘起脈絡膜血管新生のためのマウスモデル

マウス角膜と結膜のライブイメージングのためのカスタム多光子顕微鏡プラットフォーム

生体内でスペクトル領域光干渉断層法と走査レーザー眼底Cx3cr1gfp/gfpレポーター マウスの画像

単核食細胞の多パラメータフローサイトメトリック解析のためのマウス全体の眼の消化

経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

変動性を制限するための網膜静脈閉塞マウスモデルの最適化

生体内 再現性を促進するためのマウス網膜における血管損傷の読み出し

マウス後肢モデルにおける動脈形成中の白血球動員モニタリングのための多光子生体内イメージング

生体内でマルチモーダルイメージングとマウスレーザー誘発脈絡膜新生血管モデルの解析

光干渉断層撮影によるマウス脈絡膜への黒色腫の移植と評価

生体内でスペクトル領域光干渉断層法と走査レーザー眼底Cx3cr1^gfp/gfpレポーターマウスの画像

生体内再現性を促進するためのマウス網膜における血管損傷の読み出し