1型糖尿病、セリアック病、およびCOVID-19のハイスループット多重化スクリーニング

新しい6-Plex ECLアッセイは、検証され、現在、一般集団スクリーニングの臨床試験に適用されている最初のマルチプレックスアッセイです。1型糖尿病、セリアック病、COVID-19を大規模な集団でスクリーニングするのに適した6つの自己抗体アッセイを同時に組み合わせています。現在の標準的な自己抗体アッセイと比較して、この技術は、複数の自己免疫疾患に対する複数の自己抗体を同時により効率的にスクリーニングすることができる。

この技術の意味は、大規模なスクリーニングをより実行可能で疾患特異的なものにし、予防のための早期疾患予測と治療のためのより正確な診断につながります。まず、4マイクロリットルのビオチン化GAD65、SARS-CoV-2 RBD、IA-2、tTG、ZnT8、およびプロインスリン抗原タンパク質を156マイクロリットルの1%BSAを含むチューブに加え、240マイクロリットルの対応するストレプトアビジン結合リンカー1、2、3、8、9、および10と混合します。次いで、混合物を室温で30分間インキュベートする。

160マイクロリットルの停止液を各チューブに分注し、混合物を室温で30分間インキュベートします。次に、各チューブから400マイクロリットルの混合溶液を取り出し、それらを混ぜ合わせます。4マイクロリットルのルテニウム標識GAD65、SARS-CoV-2 RBD、IA-2、tTG、ZnT8、およびプロインスリン抗原を混合物に追加します。

次に、1.6ミリリットルのストップ溶液と3.2ミリリットルのPBSを追加します。すべての成分をよく混ぜます。そして今、抗原溶液はアッセイで使用する準備ができています。

96ウェルPCRプレートの場合、ウェルあたり7マイクロリットルの血清を分注し、プレートをシーリングフィルムで覆います。次に、血清をPCRマシンで摂氏56度で30分間予熱し、プレートを100倍Gで1分間短時間遠心分離します。調製した抗原溶液をウェルあたり63マイクロリットル加え、血清と混合し、PCRプレートをシーリングホイルで覆い、光を避けます。

プレートをシェーカー上で450rpmの速度で室温で2時間振とうする。次に、プレートを摂氏4度で18〜24時間インキュベートします。摂氏4度の冷蔵庫から6プレックスプレートを取り出し、プレートを室温に戻します。

次に、150マイクロリットルの3%ブロッカーAを6-Plexプレートの各ウェルに追加します。光を避けるためにプレートをホイルで覆います。プレートを摂氏4度の冷蔵庫に戻し、一晩インキュベートします。

インキュベーションの最後に、プレートが冷蔵庫から取り出されたら、プレートからすべてのバッファーを取り出します。プレートをペーパータオルの上に軽くたたいて乾かし、毎回ウェルあたり150マイクロリットルの洗浄バッファーで3回洗浄します。プレートをペーパータオル上で乾燥させ、一晩インキュベートPCRプレートの各ウェルから30マイクロリットルの血清抗原インキュベートを6-Plexプレートの2つのウェルに分注します。

プレートをホイルで覆い、プレートシェーカーに置き、室温で450rpmの速度で1時間振とうします。6-Plexプレートに存在する溶液をダンプし、ウェルあたり150マイクロリットルの0.4 M塩化ナトリウム洗浄バッファーでプレートを3回洗浄します。3回目の洗浄が完了したら、プレートをペーパータオルで乾かし、150マイクロリットルの読み取りバッファーを各ウェルに加えます。

6-Plex ECLアッセイからのGADA、IAA、IA-2A、ZnT8A、TGA、およびCOVID-19Aに対する6つの自己抗体のレベルは、対応する6つの単一ECLアッセイおよび現在の標準的な放射性結合アッセイとよく相関していました。6つの抗体全てについて各サンプルについての指標値を、対応する陽性および陰性対照に対して計算した。カットオフ値よりも大きい指標値が観察され、これは肯定的な結果を示した。

血清中の自己抗体は、ビオチン化抗原に対するルテニウム標識抗原を破り、特異的リンカーとの複合体を形成してマルチプレックスプラットフォームを構築した。この戦術により、1型糖尿病および付随する疾患の一般集団における大規模なスクリーニングがより実行可能かつ効率的になり、疾患の早期予測と予防につながります。