새로운 6-Plex ECL 분석은 검증된 최초의 멀티플렉스 분석이며 현재 일반 인구 선별을 위한 임상 시험에 적용됩니다. 대규모 인구에서 제1형 당뇨병, 체강 질병 및 COVID-19를 스크리닝하는 데 적합한 6개의 자가항체 분석을 동시에 결합합니다. 현재의 표준 자가항체 분석과 비교하여, 이 기술은 다수의 자가면역 질환에 대한 다수의 자가항체를 동시에 보다 효율적으로 스크리닝할 수 있다.
이 기술의 의미는 대규모 스크리닝을보다 실현 가능하고 질병 특이 적으로 만들어 예방을위한 조기 질병 예측과 치료를위한보다 정확한 진단으로 이어질 것입니다. 시작하려면 156마이크로리터의 1%BSA가 포함된 튜브에 4마이크로리터의 비오틴화 GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 및 프로인슐린 항원 단백질을 추가하고 240마이크로리터의 해당 스트렙타비딘 접합 링커, 1, 2, 3, 8, 9 및 10과 혼합합니다. 이어서, 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다.
160 마이크로리터의 정지 용액을 각 튜브에 분취하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다. 이제 각 튜브에서 400 마이크로 리터의 혼합 용액을 가져 와서 함께 결합하십시오. 4마이크로리터의 루테늄 표지 GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 및 프로인슐린 항원을 혼합물에 추가합니다.
그런 다음 1.6 밀리리터의 정지 용액과 3.2 밀리리터의 PBS를 첨가하십시오. 모든 구성 요소를 철저히 혼합하십시오. 이제 항원 용액을 분석에 사용할 준비가되었습니다.
96-웰 PCR 플레이트의 경우, 웰당 7마이크로리터의 혈청을 분취하고, 플레이트를 밀봉 필름으로 덮는다. 다음으로, PCR 기계에서 혈청을 섭씨 56도에서 30분 동안 예열하고 플레이트를 100배 G에서 1분 동안 잠시 원심분리합니다. 웰당 63마이크로리터의 준비된 항원 용액을 추가하고 혈청과 혼합하고 빛을 피하기 위해 PCR 플레이트를 밀봉 호일로 덮습니다.
실온에서 2 시간 동안 450rpm의 속도로 셰이커에서 플레이트를 흔든다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 4도에서 18-24시간 동안 배양합니다. 섭씨 4도 냉장고에서 6-Plex 접시를 꺼내 접시가 실온이 되도록 합니다.
그런 다음 150-Plex 플레이트의 각 웰에 3 % 차단제 A 6 마이크로 리터를 추가합니다. 빛을 피하기 위해 호일로 판을 덮으십시오. 접시를 섭씨 4도 냉장고에 다시 넣고 밤새 배양하십시오.
배양이 끝나면 플레이트가 냉장고에서 제거되면 플레이트에서 모든 버퍼를 제거합니다. 종이 타월에 접시를 두드려 말리고 매번 우물당 150마이크로리터의 세척 완충액으로 세 번 씻습니다. 플레이트를 종이 타월 상에서 건조시키고, 분취량 30 마이크로리터의 혈청 항원을 밤새 인큐베이션 PCR 플레이트의 각 웰로부터 6-플렉스 플레이트의 2개의 웰로 인큐베이션한다.
플레이트를 호일로 덮은 다음 플레이트를 플레이트 셰이커에 놓고 실온에서 450rpm의 속도로 1 시간 동안 흔 듭니다. 6-Plex 플레이트에 존재하는 용액을 덤프하고 웰당 150 마이크로리터의 0.4 M 염화나트륨 세척 완충액으로 플레이트를 3회 세척한다. 세 번째 세척이 완료된 후 종이 타월에 대해 플레이트를 말리고 각 웰에 150마이크로리터의 판독 버퍼를 추가합니다.
6-Plex ECL 분석에서 GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA 및 COVID-19A에 대한 6개의 자가항체의 수준은 해당 6개의 단일 ECL 분석 및 현재 표준 방사선 결합 분석과 잘 상관관계가 있었습니다. 모든 6개의 항체에 대한 각각의 샘플에 대한 인덱스 값을 상응하는 양성 및 음성 대조군에 대해 계산하였다. 컷오프 값보다 큰 인덱스 값이 관찰되어 긍정적 인 결과를 나타냅니다.
혈청 내 자가항체는 루테늄 표지 항원을 비오티닐화 항원에 침투시켜 특이적 링커와 복합체를 형성하여 멀티플렉싱 플랫폼을 구축했습니다. 이 전술은 제 1 형 당뇨병 및 수반되는 질병에 대한 일반 인구에서보다 실현 가능하고 효율적인 대규모 스크리닝을 만들어 질병의 조기 예측 및 예방으로 이어집니다.
