Yeni 6-Plex ECL testi, doğrulanmış ve şimdi genel popülasyon taraması için klinik çalışmalarda uygulanan ilk multipleks tahlildir. Aynı zamanda, büyük bir popülasyonda tip 1 diyabet, Çölyak hastalığı ve COVID-19 taraması için uygun altı otoantikor tahlilini birleştirir. Mevcut standart otoantikor testi ile karşılaştırıldığında, bu teknik aynı anda çoklu otoimmün hastalık için çoklu otoantikorları daha verimli bir şekilde tarayabilir.
Bu tekniğin anlamı, büyük ölçekli taramayı daha uygulanabilir ve hastalığa özgü hale getirecek, önleme için erken hastalık tahminine ve tedavi için daha kesin tanıya yol açacaktır. Başlamak için, 156 mikrolitre% 1 BSA içeren bir tüpe dört mikrolitre biyotinile GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 ve proinsülin antijen proteini ekleyin ve 240 mikrolitre karşılık gelen streptavidin-konjuge bağlayıcılar, 1, 2, 3, 8, 9 ve 10 ile karıştırın. Daha sonra, karışımı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
Aliquot 160 mikrolitre durdurma çözeltisi her tüpe girer ve karışımı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Şimdi, her tüpten 400 mikrolitre karışım çözeltisi alın ve bunları bir araya getirin. Karışıma dört mikrolitre rutenyum etiketli GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 ve proinsülin antijeni ekleyin.
Ardından, 1,6 mililitre durdurma çözeltisi ve 3,2 mililitre PBS ekleyin. Tüm bileşenleri iyice karıştırın. Ve şimdi, antijen çözeltisi tahlilde kullanıma hazırdır.
96 delikli bir PCR plakası için, kuyu başına yedi mikrolitre serum alın ve plakayı bir sızdırmazlık filmi ile örtün. Daha sonra, serumu bir PCR makinesinde 30 dakika boyunca 56 santigrat derecede önceden ısıtın ve plakayı bir dakika boyunca 100 kez G'de kısaca santrifüj edin. Kuyucuk başına 63 mikrolitre hazırlanmış antijen çözeltisi ekleyin, serumla karıştırın ve ışığı önlemek için PCR plakasını sızdırmazlık folyosu ile örtün.
Plakayı oda sıcaklığında iki saat boyunca 450 rpm hızında bir çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. Ve sonra, plakayı 18 ila 24 saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Dört santigrat derece buzdolabından 6-Plex bir plaka alın ve plakanın oda sıcaklığına gelmesine izin verin.
Ardından, 6-Plex plakanın her bir kuyucuğuna 150 mikrolitre% 3 Bloker A ekleyin. Işıktan kaçınmak için plakayı folyo ile örtün. Tabağı dört santigrat derecelik bir buzdolabına geri koyun ve gece boyunca kuluçkaya yatırın.
Kuluçkanın sonunda, plaka buzdolabından çıkarıldıktan sonra, tüm tamponu plakadan çıkarın. Kuruması için kağıt havluların üzerindeki tabağı okşayın ve her seferinde kuyucuk başına 150 mikrolitre yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Plakayı kağıt havlu üzerinde kurutun ve gece boyunca inkübe edilen PCR plakasının her bir kuyucuğundan 6-Plex plakanın iki kuyucuğuna 30 mikrolitre serum antijeni inkübe edin.
Plakayı folyo ile örtün, ardından plakayı bir plaka çalkalayıcıya koyun ve bir saat boyunca oda sıcaklığında 450 rpm hızla çalkalayın. 6-Plex plakada bulunan çözeltiyi boşaltın ve plakayı kuyu başına 150 mikrolitre 0,4 M sodyum klorür yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Üçüncü yıkama tamamlandıktan sonra, plakayı kağıt havluya karşı kurutun ve her bir oyuğa 150 mikrolitre okuma tamponu ekleyin.
6-Plex ECL tahlilinden GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA ve COVID-19A için altı otoantikor seviyesi, karşılık gelen altı tek ECL testi ve mevcut standart radyo bağlama testi ile iyi korelasyon gösterdi. Altı antikorun tümü için her numunenin indeks değerleri, karşılık gelen pozitif ve negatif kontrollere karşı hesaplandı. Kesme değerinden daha büyük bir endeks değeri gözlendi ve bu da olumlu bir sonuca işaret etti.
Serumdaki otoantikorlar, biyotinile antijene karşı rutenyum etiketli antijeni ihlal etti ve çoklayıcı bir platform oluşturmak için spesifik bir bağlayıcıya sahip bir kompleks oluşturdu. Bu taktik, birinci tip diyabet ve eşlik eden hastalıklar için genel popülasyonda büyük ölçekli taramayı daha uygulanabilir ve daha verimli hale getirir ve hastalıkların erken tahmin edilmesine ve önlenmesine yol açar.
