Der neuartige 6-Plex ECL-Assay ist der erste Multiplex-Assay, der validiert und nun in klinischen Studien für das Screening der Allgemeinbevölkerung eingesetzt wird. Es kombiniert gleichzeitig sechs Autoantikörper-Assays, die für das Screening von Typ-1-Diabetes, Zöliakie und COVID-19 in einer großen Population geeignet sind. Im Vergleich zum aktuellen Standard-Autoantikörpertest kann diese Technik mehrere Autoantikörper effizienter auf mehrere Autoimmunerkrankungen gleichzeitig untersuchen.
Die Implikation dieser Technik wird das groß angelegte Screening praktikabler und krankheitsspezifischer machen, was zu einer frühen Krankheitsvorhersage für die Prävention und einer präziseren Diagnose für die Therapie führt. Fügen Sie zunächst vier Mikroliter biotinyliertes GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 und Proinsulinantigenprotein in ein Röhrchen mit 156 Mikrolitern 1% BSA hinzu und mischen Sie es mit 240 Mikrolitern entsprechender Streptavidin-konjugierter Linker, 1, 2, 3, 8, 9 und 10. Dann inkubieren Sie die Mischung für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
Aliquot 160 Mikroliter Stopplösung in jedes Röhrchen und inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Nehmen Sie nun 400 Mikroliter der Mischungslösung aus jedem Röhrchen und kombinieren Sie sie miteinander. Fügen Sie der Mischung vier Mikroliter Ruthenium-markiertes GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 und Proinsulinantigen hinzu.
Dann fügen Sie 1,6 Milliliter Stopplösung und 3,2 Milliliter PBS hinzu. Mischen Sie alle Komponenten gründlich. Und jetzt ist die Antigenlösung bereit für den Einsatz im Assay.
Für eine 96-Well-PCR-Platte aliquotieren Sie sieben Mikroliter Serum pro Vertiefung und bedecken Sie die Platte mit einem Siegelfilm. Als nächstes heizen Sie die Seren bei 56 Grad Celsius für 30 Minuten auf einer PCR-Maschine vor und zentrifugieren die Platte kurz bei 100 mal G für eine Minute. Fügen Sie 63 Mikroliter vorbereitete Antigenlösung pro Vertiefung hinzu, mischen Sie sie mit den Seren und bedecken Sie die PCR-Platte mit Siegelfolie, um Licht zu vermeiden.
Schütteln Sie die Platte auf einem Shaker mit einer Drehzahl von 450 U/min für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Und dann die Platte bei vier Grad Celsius für 18 bis 24 Stunden inkubieren. Nehmen Sie eine 6-Plex-Platte aus dem vier Grad Celsius warmen Kühlschrank, damit die Platte Raumtemperatur erreicht.
Fügen Sie dann 150 Mikroliter 3% Blocker A zu jeder Vertiefung der 6-Plex-Platte hinzu. Decken Sie die Platte mit Folie ab, um Licht zu vermeiden. Stellen Sie den Teller zurück in einen vier Grad Celsius heißen Kühlschrank und brüten Sie ihn über Nacht aus.
Am Ende der Inkubation, sobald die Platte aus dem Kühlschrank entfernt wurde, entfernen Sie den gesamten Puffer von der Platte. Tupfen Sie den Teller zum Trocknen auf die Papiertücher und waschen Sie ihn jedes Mal dreimal mit 150 Mikrolitern Waschpuffer pro Brunnen. Trocknen Sie die Platte auf dem Papiertuch und aliquot inkubieren 30 Mikroliter Serumantigen aus jeder Vertiefung der über Nacht inkubierenden PCR-Platte in zwei Vertiefungen der 6-Plex-Platte.
Decken Sie die Platte mit Folie ab, legen Sie die Platte dann auf einen Plattenschüttler und schütteln Sie sie eine Stunde lang mit einer Geschwindigkeit von 450 U/min bei Raumtemperatur. Die vorhandene Lösung wird in die 6-Plex-Platte gekippt und die Platte dreimal mit 150 Mikrolitern 0,4 M Natriumchlorid-Waschpuffer pro Vertiefung gewaschen. Nachdem die dritte Wäsche abgeschlossen ist, trocknen Sie die Platte gegen das Papiertuch und geben Sie 150 Mikroliter Lesepuffer in jede Vertiefung.
Die Konzentrationen von sechs Autoantikörpern für GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA und COVID-19A aus dem 6-Plex ECL-Assay waren gut mit den entsprechenden sechs einzelnen ECL-Assays und dem aktuellen Standard-Radiobindungstest korreliert. Die Indexwerte für jede Probe für alle sechs Antikörper wurden gegen die entsprechenden Positiv- und Negativkontrollen berechnet. Es wurde ein Indexwert beobachtet, der größer als der Cutoff-Wert war, was auf ein positives Ergebnis hindeutete.
Autoantikörper im Serum durchbrachen das Ruthenium-markierte Antigen zum biotinylierten Antigen und bildeten einen Komplex mit einem spezifischen Linker, um eine Multiplexing-Plattform aufzubauen. Diese Taktik macht das groß angelegte Screening in der Allgemeinbevölkerung für Typ-Eins-Diabetes und Begleiterkrankungen praktikabler und effizienter, was zu einer frühzeitigen Vorhersage und Prävention der Krankheiten führt.
