私たちのプロトコルは、肝臓切片のコラーゲンが豊富な領域とコラーゲンが不足している領域を区別します。したがって、線維形成の過程をより詳細に研究するために使用することができます。この技術の主な利点は、偏光顕微鏡を使用して肝臓切片のコラーゲンが豊富な領域を見つけることにあります。
私たちのプロトコルは、肝線維症の発症に関する優れた洞察を提供することができ、特定の最適化後に肺などの他の軟部組織にも採用できます。まず、凍結した肝臓切片をマイナス80°Cから取り除き、室温で2分間解凍します。氷冷した4%パラホルムアルデヒドでPBSで摂氏4度で10分間固定し、続いてPBSで5回洗浄します。
最後の洗浄後、組織を使用して肝臓切片の周りの余分なPBSを拭き取り、疎水性マーカーペンで肝臓切片の周囲約2 x 4センチメートルの境界に印を付けます。サンプルをPBSで覆い、次にサンプルをAFMステージにロードし、AFMヘッドで覆います。原子間力顕微鏡またはAFMソフトウェアで、[セットアップ]タブに移動し、自動保存にチェックマークを付けて、すべてのファイルを自動的に保存します。
次に、セットアップタブに移動し、設定の保存をクリックして、測定ファイルを保存するためのファイル名とディレクトリを指定します。AFMカンチレバーで組織表面にアプローチするには、レーザーのスイッチを入れ、アプローチキーをクリックします。アプローチが完了したら、リトラクションキーを1回クリックしてカンチレバーチップを引っ込めると、カンチレバーがピエゾ範囲の上端まで引っ込められます。
必要に応じて、AFMヘッドのノブを使用して検出器を再調整します。レーザーをオフにします。これで、ヒントが目的の焦点になりました。
次に、アクセサリータブをクリックし、直接オーバーレイ光学キャリブレーションを選択して、顕微鏡の光学フィールドをAFM測定マップにオーバーレイします。次のウィンドウで、[次へ]をクリックして、特定の領域をスキャンするカンチレバーの一連の画像を撮ります。もう一度[次へ]をクリックして、次のウィンドウに移動します。
最初の画像では、カンチレバーの先端の中央を手動でクリックして、ソフトウェアで先端の位置を示しています。先端位置を表す円は、その半径を示すことでサイズを操作し、精度を高めることができます。キャリブレーションをクリックすると、すべての画像で片持ち梁の先端位置が自動的に検出されます。
画像を見て、チップ検出の精度を確認します。[次へ] をクリックし、[完了] をクリックして光学オーバーレイを終了します。次に、ステージを移動し、偏光画像を使用して、データビューアタブに表示される緑色のボックス内にコラーゲンが豊富な領域を配置します。
グリッドタブの下の領域を定義し、指定した緑色のボックス内でマウスの左ボタンを長押ししてデータビューアタブに長方形を作成することで、コラーゲンが豊富な領域を選択します。[新しいスキャン領域の確認]をクリックして、選択した領域を測定領域として設定します。フィードバックループのパラメータを設定します。
Iゲインを50ヘルツに設定し、Pゲインを0.001に設定します。次に、設定値を1ナノニュートンに設定します。調査した材料の機械的特性とカンチレバーの剛性に応じて、相対的な設定値を選択します。
力曲線に適切に適合するように、ジャストベースラインを指定します。次に、サンプルの表面トポグラフィーに応じて、Z軸のカンチレバーの動きの長さを選択します。Z 移動を一定時間に設定します。
延長時間を 1 秒に設定し、延長とリトラクションの遅延をゼロに設定します。サンプルレートを5, 000ヘルツに設定します。Z閉ループの前に目盛りを付けると、測定中にサンプルとカンチレバー先端の間の距離が自動的に調整されます。
次に、エンゲージボタンの選択を解除して、電動ステージコントロールを解除します。レーザーのスイッチを入れ、カンチレバーでサンプルに近づきます。スキャンの開始をクリックして、力の距離曲線を収集します。
取得したデータをオープンソースソフトウェアAtomicJで解析します。プロセス力曲線とマップアイコンをクリックして、力曲線をプログラムにロードします。次に、処理アシスタントで、追加ボタンをクリックして分析するマップを追加します。
マップが読み込まれたら、[次へ]をクリックします。次のウィンドウで処理設定を指定します。一連のフィッティング曲線パラメータを使用してサンプルとカンチレバーの間の接触点を自動的に推定するには、接触点の自動推定を使用します。
カンチレバーとサンプルの接触点を、古典的な集束グリッド法で決定します。データ解析の最適化中に経験的に決定する必要がある測定された力曲線の品質に基づいて接触点の最良の決定を得るために、モデルに依存しない方法として推定方法を選択します。モデルフィットの古典L 2として古典モデルを使用して力のくぼみ曲線をフィットします。
離脱曲線に対するモデルの適合を設定します。ポアソン比を0.45に設定し、肝臓などの軟部組織に推奨します。ベースライン角度 3 と接触角度 1 を使用して曲線のフィットを設定します。
モデルからの曲線の偏差のスケールに基づいて多項式適合度を変更します。撤退曲線の適合に使用するモデルをスネードンモデルとして選択します。球形の先端の半径を2.9マイクロメートルに記入します。
読み込みを有効にしてデータファイルからばね定数とinvOLSをロードし、[完了]をクリックします。データ分析後、力曲線を通過します。カンチレバーが肝臓セクションの表面に誤って接近した力曲線を除外します。
これらの曲線は、高いノイズと異常な形状を持っています。この後、データをコピーまたはエクスポートできます。この研究では、対照マウスおよび四塩化炭素の注射によって誘発された軽度および進行した線維症を有するマウスから得られた軽度に固定された肝臓切片をAFMでプローブした。
四塩化炭素マウスのコラーゲン線維が通常形成する領域に対応する中心静脈に近い領域を、対照肝臓で分析した。ヤング率の分布は、単一の肝臓切片内の対照肝臓およびコラーゲンリッチ領域の異なる領域にわたって再現可能でした。四塩化炭素処理マウスにおいて、コラーゲン沈着物の周辺領域に対応する剛性マップは、対照マウスにおける同等の領域と比較してヤング率の有意に高い値を示した。
さらに、より長い治療でヤング率の値の有意な増加があった。コラーゲン線維の機械的特性に対する肝臓切片の長期保存の影響も評価された。AFM測定は、2週間以内に得られたものと比較して、3ヶ月間保存された切片のコラーゲンリッチ領域におけるヤング率の有意な低い値を示した。
肝切片の固定時間は、肝切片の機械的性質を大きく左右する。プロトコルに記載されている時間間隔に厳密に従うことをお勧めします。プロトコルにおける特定の最適化の後、与えられた方法は、偏光顕微鏡によって検出可能な有意なコラーゲン沈着を示す任意の軟組織に使用することができる。
与えられた技術は、健康と病気にわたる肝臓のメカニズムを研究するための統一された便利なプロトコルを研究者に提供します。
