このプロトコルは、超解像顕微鏡、特に直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORMとも呼ばれる)を採用し、回折限界を迂回し、ナノメートル精度のEVを3次元で可視化します。dSTORMの1つの顕著な利点は、EVの生化学的性質を変化させるステップを損傷することなく、光の回折レベルの下の粒子を直接視覚化する能力です。多くの進化的に異なるウイルスはEVシグナル伝達を採用しているため、疾患バイオマーカーや進行性のEVを特徴付けるとともに、SARS-CoV2などの個々のウイルス粒子を可視化するためにdSTORMを用いることができる。まず、アフィニティ精製、細胞外小胞、またはEVをガラス底、マイクロスライド、8ウェルプレートの合計体積200マイクロリットルに配置し、摂氏4度で一晩表面に付着させることから始めます。
8ウェルプレートから既存の溶液を取り除かずに、各ウェルのEV含有溶液に1X PBSに4%パラホルムアルデヒドの200マイクロリットルを加えてプレートにEVを固定し、プレートを室温で30分間インキュベートできるようにします。慎重に、パラホルムアルデヒドと余分な溶液をマイクロピペットで除去し、EVを乱さない。1X PBSでEVを洗浄し、過剰なパラホルムアルデヒドを除去します。
洗浄手順を3回行います。余分な1X PBSを取り除きます。メーカーのプロトコルに従ってイメージングバッファーで希釈した5ミリモル原作ジオキシゲナーゼの溶液を作成することにより、サンプル当たり250マイクロリットルのdSTORM Bcubedバッファー溶液を調製します。
製造したバッファーの 250 マイクロリットルをメーカーのプロトコルに従ってそれぞれに加え、室温でプレートを 20 分間インキュベートしてから、酸化分子を清掃します。EVは、すぐに視覚化したり、摂氏4度で1週間保存することができます。超分解能顕微鏡の較正に必要なビーズを調製するために、分子生物学グレードの水の濃度0.5%に100ナノメートルのマイクロスフェアを希釈し、ピペット200マイクロリットルをガラス底、マイクロスライド、8ウェルプレートの各ウェルに入れます。
ビーズを室温で1時間井戸に落ち着かせる。既存の溶液を除去することなく、PBSに4%パラホルムアルデヒドの200マイクロリットルを各ウェルに加えて、キャリブレーションビード溶液に加え、室温で30分間インキュベートします。マイクロピペットでパラホルムアルデヒドを慎重に取り出してビーズを邪魔しないようにし、1X PBSでビーズを3回洗います。
原稿に記載されているとおりにバッファを準備します。1X PBSを取り出し、準備したバッファーの 250 マイクロリットルを各ウェルに追加します。バッファーをビジュアライゼーションの前に 20 分間待機させます。
ステージ上に何かを配置する前に、3D顕微鏡に接続するには、「顕微鏡を接続」ボタンを使用します。目的に100X油を加え、目的の上に井戸の中心を置きます。取得設定で、473および640ナノメートルの励起レーザーをオンにして、[表示]をクリックします。
3D レンズをアクティブにすることなく、[イメージ表示オプション]の[フォトン数]をクリックして、フォトンの彩度設定の下にビーズを表示します。最初のレーザーパワーを473ナノメートルレーザーの場合は8.4ミリワット、640ナノメートルレーザーでは11.6ミリワットに設定します。レーザーの焦点をマイナス300ナノメートルまたはキャリブレーションビーズの焦点面に下げ、個々のビーズの明確な解像度を生成します。
Z面が焦点を合わせられたら、レーザーパワーレベルを調整して、各視野の変動を考慮します。インストゥルメント関数で、3D マッピングキャリブレーションとチャネルマッピングキャリブレーションを完了して、X、Y、Z 軸の誤差を取得します。ビューの最大フィールド数を 20、目標のポイント数を 4,000、チャネル間の最大距離を 5.0 ピクセルに設定し、チャネルマッピングのキャリブレーション中にチャネル間の除外半径を 10.0 ピクセルに設定します。
キャリブレーションにより、90%を超えるポイントカバレッジと、良好なマッピング品質が得られます。将来の画像取得のために、指定されたキャリブレーションデータを保存します。目的に100X油を加え、準備したEVを顕微鏡に置きます。
3Dレンズを有効にすることなく、640ナノメートルの励起レーザーをオンにし、最初に赤い膜を励起する視野の信号の強度に応じて1.2〜12.5ミリワットに上げます。[イメージ表示オプション] で、表示方法をフォトン飽和から百分位数に切り替えて、EV をより適切に視覚化します。信号を最大化しながらノイズを最小限に抑え、他のすべてのパラメータを維持するためにレーザーパワーを調整します。
Z 軸の上または下のアイコンをクリックして、Z 平面のフォーカスを調整します。露出時間を 20 ミリ秒、フレーム キャプチャを 10,000 フレームに、初期レーザーパワーを 1.2 ~ 12.5 ミリワットに設定します(信号の強度と視野の表示範囲に応じて)。アイコンを使用して3Dレンズをアクティブにし、取得ボタンをクリックして取得を開始します。
画像取得プロセス全体を通して、1000 フレームごとに 10 ずつ、または高い信号対雑音比を維持するのに十分な単位でレーザーパワーを上げます。取得中に Z 平面を調整しないでください。画像の取得後、[分析] 表示ウィンドウに切り替えます。
フィルタされていない画像に対してドリフト補正を実行し、フィルタをアクティブにします。原稿で述べたように、フォトン数、ローカリゼーション精度、シグマ、フレームインデックスを調整します。X、Y、Z 平面ビュー ツールを、視野から個々の EV の X 軸に沿ってオーバーレイし、フォトスイッチング イベントの個々の csv ファイルをエクスポートします。
ライン ヒストグラム ツールを使用して、X、Y 軸の X、Y 軸上の個々の EV を 2 分、X 座標方向の視野を使用して、フォトスイッチング イベントを設定された距離グループにピンで固定します。単一のEVの画像を撮り、tifファイルとして保存します。3D 視覚化ツールを使用して、個々の EV の 3D ビデオを作成し、Z 軸に沿った配置に従って色を指定します。
X、Y軸、38ナノメートルの平均誤差をZ軸で生成した顕微鏡のキャリブレーションに続いて、精製されたu20s EVは、X、Y軸、Z軸に沿って50ナノメートルまでの解像度で正常に視覚化されました。3D光光交換でdSTORMを介して可視化された個々のEVは、レーザーパワーが増加するにつれて10,000フレーム露光を通して、取得した画像で容易に明らかであった。Z平面における取得後の画像補正、フォトン数、シグマ、および再構成された画像のローカリゼーション精度は、3DでのEVの明確な解像度をもたらしました。
EV は、右上隅の凡例に見られるように、最初の 7,000 フレームの間だけ光スイッチを入れました。ヒストグラムは、光スイッチングイベントの大半が半径100ナノメートル以内で発生したことを確認し、可視化されたEVがエキソソームであり、小径のEVの分離が成功したことを検証する。ラインヒストグラムツールとX,Y,Z平面ビューツールを使用して、他の個別にトレースされたEVで行われたサイズ分布解析により、ほとんどの光スイッチングイベントが中心の半径100ナノメートル以内で発生したことを確認しました。
Z軸に沿った誤差が増加し、軸軸に沿ったEVの細長い最終画像が生成されました。光スイッチングイベントはEVサイズと相関しておらず、dSTORMベースの特性化がエキソソームや直径100ナノメートル未満の小さなエンベロープウイルスのような小さなEVに使用できることを実証しました。dSTORMを実行している間は、最初のレーザーパワーを非常に低く設定し、光の漂白を防ぐために画像取得全体を通してゆっくりと上げることを覚えておくことが重要です。
開発以来、dSTORMは、典型的な光顕微鏡の回折限界のために以前は視覚化が不可能であったサブ細胞構造の形態をよりよく理解することを可能にしました。
