この方法は、現場で共通の問題に対処し、関心のある特定のマーカーを持つ単一の細胞外小胞を迅速に分離し、特性を定める完全なワークフローを提供します。ナノ粒子追跡解析は、半自動化された方法です。これは、光散乱とブラウン運動の特性を利用して、細胞外小胞のサイズ分布を分析します。
この手順のデモンストレーションは、当研究室の博士課程の学生、ベラ・シュミットです。細胞外小胞を単離するために、ヒト全血の2ミリリットルサンプルを血清分離管に集めた後、遠心分離によって細胞を血清から分離する前に、試料を室温で15分間凝集させる。各サンプルから1ミリリットルの血清を個々の1.5ミリリットル反応チューブに移して遠心分離して血小板を除去し、血小板不良血漿の100マイクロリットルを新しい1.5ミリリットル反応チューブに移します。
次に、25マイクロリットルのエキソソーム沈殿液をプラズマに加え、試料を完全に渦液に加えます。氷上で30分間のインキュベーションの後、遠心分離によって細胞外小胞を採取する。ペレットはベージュまたは白色で表示されます。
上清を吸引し、再び遠心分離機を用いた。その後、液体のすべてのトランスを除去し、PBSの100マイクロリットルでペレットを再懸濁します。小胞の細胞膜を染色するには、EV懸濁液の10マイクロリットルを、調製したPKH67エタノール染料溶液の50マイクロリットルに加え、十分に混合します。
暗闇の中で室温で5分後、染色された細胞外小胞懸濁液の50マイクロリットルを15ミリリットルの円錐形チューブに2.5ミリリットルの蒸留水で希釈し、完全に混合する。抗体でベシクルを標識するには、1.5ミリリットルの反応チューブに50マイクロリットルの蒸留水を含む未染色細胞外小胞懸濁液の10〜20マイクロリットルを徹底的に混合して希釈する。暗い室温で30分間インキュベーションするために、徹底的な混合で、対象となる抗体の2.5〜5マイクロリットルを反応管に加えます。
次に、標識ベシクルの50マイクロリットルを、蒸留水の適切な実験量を含む15ミリリットルの円錐管に移し、完全な混合を行い、表に示されるようにする。染色または標識された細胞外小胞を分析する前に、まず蛍光フィルターを顕微鏡とカメラの光学経路に移動し、自動実装のための画面の指示に従ってプログラムを開始します。[セルチェック]タブで、蛍光測定用の正しいセル番号と光学系の基準位置を選択し、レーザーと顕微鏡が共通の焦点であることを確認します。
シリンジを使用して、10ミリリットルの蒸留水で細胞チャネルを洗い流し、測定セルに気泡がなく、気泡がシステムに注入されないことに注意してください。次に、蒸留水990マイクロリットルで200ナノメートルサイズの蛍光標識ポリスチレン粒子を10マイクロリットル希釈し、この粒子懸濁液の10マイクロリットルを10ミリリットルの蒸留水を含む15ミリリットルのチューブに加える。次に、最初の希釈粒子溶液を2.5ミリリットルのセルチャネルに注入し、「フォーカスを最適化」をクリックしてカメラを調整します。
サンプルを測定するには、10ミリリットルの蒸留水で細胞チャネルを複数回洗い流し、染色された細胞外小胞懸濁液を注入する。参照位置を使用して、表に示すように、[セルチェック]タブで適切な取得パラメータを調整します。最適な感度範囲を特定するには、[パーティクル数との対]をクリックします。
感度は、異なる感度レベルに対して画面上当たりの測定粒子の曲線を表示する。Shutter パラメーターでは、カメラが指定した間隔でライトを通過できる時間間隔を調整します。[取得後パラメータ]では、最小輝度 20、最小サイズ 20 ナノメートル、最大測定サイズ 500 ナノメートルを選択します。
ディスプレイの視野で検出されたパーティクルの数に注意してください。散乱バーは緑色からオレンジ、50〜300粒子の範囲でなければなりません。[ゼロボルトでパーティクルドリフトをチェック]をクリックし、[計測]タブを開きます。
[ビデオの取得を実行] をクリックし、[実験の数] を 3 ~ 5 に設定し、[実験の間隔] を 0 分に設定します。個々のサブボリューム位置の数を 11 に設定し、測定サイクルの数を、パーティクルを分析する各測定位置で 10 に設定します。次に、フォルダーを選択し、新しいファイル名を作成し、[問題] をクリックして測定を開始します。
解析の最後に、[解析]タブを開いて結果を確認します。次に、1位置あたりの平均粒子数、粒子の総数と粒子濃度、粒子の分布幅、平均値、標準偏差などを確認する。測定の調整および口径測定に蛍光ビーズを使用すると、85%の最適な設定感度を与えるこれらの設定を使用して、カメラはシャープな画像を表示し、測定を繰り返し低標準偏差を示します。
緑色蛍光色素を長持ちする蛍光色素を含む蛍光細胞リンカーキットで染色すると、細胞膜の脂質領域に脂肪族の尾が入り込み、測定された粒子数と感度との間に強い相関関係が明らかになる。細胞外小胞染色抗体は、目的のタンパク質に対して、ピーク最大サイズ541ナノメートルの220〜145ナノメートルの粒子分布を示す。細胞外小胞は、コントロール小胞を含まない水の抗体染色後に検出されず、100%に近い感度までドリフトが毎秒5マイクロメートルを超える場合に測定が開始されると、個々の反復は明確な偏差を示す。
このフルオロフォアは急速な光漂白を起こしやすいので、フルオロクロムとしてフッ素イソチオシアネートを使用すると不正確で再現性の高い測定が行われなくなります。このプロトコルは、特定のマーカーを使用して、単一の細胞外小胞の迅速な特性評価のために、この分野の多くの研究者の主要な需要に対処します。過去10年間に、方法が大幅に改善されたにもかかわらず、単一の細胞外小胞の分析のための標準化されたプロトコルはまだありません。
この方法は、細胞外小胞生物学に関する研究の今後の進展に関係なく、特定のマーカーを用いた単一の細胞外小胞の特徴付けに対して、迅速かつ信頼性の高いプロトコルを提供する。現在のプロトコルは処理時間が長く、作業負荷のかかるステップも必要としないため、高いサンプルスループットにも適しています。
