乳がんは、重篤な負の副作用を伴う予防戦略が限られている、一般的で致命的な病気です。副作用の少ない方法を提供するために、ラット乳管樹へのエタノールベースのアブレーション液を管内注射し、in vivoイメージングと乳がん予防を同時に可能にする技術を開発しました。これは、乳頭開口部に直接注射することで、乳副組織損傷を最小限に抑えて乳腺上皮細胞を標的化できるマウスでの以前の研究に基づいています。
マウスとラットの両方が乳頭開口部に由来する単一の乳管樹を含む乳腺を持っています。ラットはマウスよりも大きく、アブレーションの成功を研究するために大量のエタノールを注射して、モデルのスケーラビリティを証明することができます。この方法の別の改良は、アブレーション溶液へのエチルセルロースの添加である。
エチルセルロースは、標的とする領域からエタノールの拡散を減らすために、他の臨床アプローチで以前に使用されてきました。これは、化合物の性質によって達成され、組織内の液体に接触すると化合物がゲル化します。画像検証された乳がん予防のこの方法には、5つの重要なステップがあります。
まず、実験室で調製したスクラロースゲルカップを利用して、動物にカルプロフェンを経口投与し始める必要があります。この拡張抗炎症治療は、手続きの前後に維持されます。.次に、乳首の周囲から毛皮を取り除き、脱毛クリームを注射して動物を注射する準備をします。
次に、乳管内注射は、針挿入のための乳首開口部の視覚化を支援するステレオスコープを使用して実行されます。注射の成功を判断するために、注射後にマイクロCTまたは透視法によって動物をスキャンまたは評価します。次に、マイクロCTスキャンを処理して、注入された乳管樹の3D再構成を作成し、成功した充填をさらに分析することができます。
ストックカルプロフェンは、最初にPVSで必要な濃度に希釈されます。カップのスクラロースへの薬物の完全な混合をよりよく確認するために、滅菌食用染料を混合物に添加してもよい。次に、カップを摂氏60度の水浴中で15分間加熱します。
取り外し時にカップを乾燥させ、カップの蓋を70%エタノールで洗浄すると、汚染のリスクが軽減されます。カルプロフェン溶液は、蓋を突き刺すために注射器を使用してカップに直接注入することができる。この場合、望ましい結果を得るには500マイクロリットルを注入する必要があります。
カップを15秒間振ってから、さらに15秒間ボルテックスする前に、ステッカーで穴を塞いでください。均質な混合は、濃い青の塊を探すことによって評価できます。その後、カップは必要になるまで冷蔵できます。
動物は注射が行われる2〜3日前に準備されるべきです。吸入剤イソフルランを使用して動物を麻酔する。麻酔をかけたラットを加温パッドのノーズコーンに移します。
ノーズコーンにいる間にラットにアイローションを塗布し、動物を背中に置きます。脱毛クリームは、綿の先端のアプリケーターで注入する予定の乳首の領域に適用できます。毛皮のより速い緩みは、所望の領域の動物の皮膚を横切ってアプリケーターを上下にこすることによって達成することができる。
皮膚を火傷しないように、クリームをラットにできるだけ短い時間放置することが重要です。ラットはこの手順に対してマウスよりもさらに敏感です。10〜30秒塗布した後、ガーゼに温水を使用してクリームを完全に取り除きます。
きれいなガーゼで皮膚を乾かす前に、3〜4回のすすぎを使用して完全に除去してください。毛皮除去の領域で良好な視認性と乳首へのアクセスを確認します。必要に応じて脱毛手順を繰り返します。
ラットを加温パッドの上の清潔な回復ケージに入れて、麻酔から回復します。回復後、家のケージで準備されたラットにカルプロフェンカップを1つ与えます。吸入剤イソフルラン麻酔を使用して動物に麻酔をかけることから始め、完全に誘導されたらラットをノーズコーンに移動します。
注射のために動物を背中に置く前に、目の潤滑剤を塗布する必要があります。注射されるが必須ではない乳首の近くの脚をテープで留めると便利です。希望の量の注射液で注射器を準備したら、可能であれば先端の細かい鉗子を使用して目に見える死んだ皮膚を取り除き、乳首を準備します。
最も一般的な懸念事項は、乳首の開口部自体です。ラットはしばしば開口部から突き出たプラグを持っています。このプラグを取り外すと、カニューレ挿入を改善するのに役立ちます。
針の斜角が見える状態で、先端の細い鉗子のガイダンスの助けを借りて、針を乳首の先端に挿入します。乳首の開口部の経路をたどるように注意してください。ラットの乳首は開口部の周りにより多くの脂肪を持っている傾向があるため、この脂肪に突き刺さりやすく、針の前進によりカニューレ挿入を達成したと誤って信じてしまいます。
針のベベルが乳首に完全に囲まれたら、ゆっくりと溶液を注入し始めます。望ましい速度は、ラットで毎分約100マイクロリットルです。管樹への損傷を防ぐために、これよりも早く注入することは避けてください。
完全に注射した後、鉗子の助けを借りて乳首から針を外す前に30秒待ちます。これにより、乳首からの漏れの可能性が低くなります。漏れが発生した場合は、湿らせたガーゼまたはエタノールワイプを使用して溶液をきれいにします。
コントラストやこぼれた溶液は、取得した画像を歪める可能性があります。ここには、表示されたばかりの射出シーケンスの拡大ビデオが表示されます。動物の呼吸により、乳首を単一の焦点面に保つことが困難になることに注意してください。
これにより、乳首が一定の場所に留まらないため、注射がより困難になる可能性があります。この問題は、胸郭と上位3つの腺ペアが近接しているために悪化します。ニップル開口部のプラグは、カニューレ挿入を改善するために取り外されました。
針は、鉗子の助けを借りて乳首に進められるように斜角を向くことができます。ベベルが完全に挿入されると、注入を開始できます。乳首の左側を注意深く見ると、注射液が管の木を通して広がってわずかに見えるところに、青い色合いの増加に気付くかもしれません。
これは、皮膚が厚いため、ラットでははるかに目立ちません。ここでは、注入が完了してから30秒後に針が除去され、結果として生じる溶液が乳首からこぼれるのを見ることができます。余分な溶液はきれいにされ、脂肪パッド注射を示す乳首や領域のドミングに外傷が見られない領域の評価が可能になります。
エタノールを含む溶液を注射する場合は、アルコール中毒を避けるように注意する必要があります。これには、1回のセッションで注入できるエタノールの量を知り、その影響を打ち消すために手順中にスクロース含有溶液IPを投与する必要があります。注射後、動物は加熱パッド上の清潔なケージで回収されるか、注射成功の画像化のためにマイクロCTに移動され得る。
注射した動物をマイクロCT装置に移動させた後、イメージング中の麻酔を維持するためにイソフルランの投与を続けます。ラットのサイズが大きくなると、良好な画像を得るために追加の位置操作が必要になります。画像化する部位の近くで脚をテーピングする前に背骨をまっすぐにすると、一貫した画像を生成するのに役立ちます。
脚を伸ばした位置にテーピングすると、骨が画像の焦点になるのを防ぐことができます。また、ラットの腹部をテーピングすると、下腺の呼吸アーチファクトを減らすのに役立つこともわかりました。いくつかのスキャンパラメータは、管治療の視覚化のために許容される。
ただし、パラメータを選択する際には、常に放射線量を考慮する必要があります。これらのスキャンから生じる放射線量は、特定の系統のラットの放射線制限を超えてはなりません。画像取得ではなく透視分析により、全体的な放射線負荷を大幅に軽減できます。
すべてのスキャンまたは評価が行われたら、動物は加温パッドの清潔な回復ケージに戻すことができます。動物は完全に回復してホームケージに戻るまで監視する必要があります。カルプロフェンカップは、注射後少なくとも7日まで提供する必要があります。.
私たちが使用するmicroCT装置のソフトウェアを使用すると、正式な分析なしで注入の成功を評価するための迅速なレンディションを作成できます。この機能には、合理的な信号対ノイズリダクションを可能にするシンプルなコントラストスライダーがあります。これらのレンディションの主な欠陥は、画像全体を同時にしきい値に設定する必要があることです。
これにより、食事中の鉄など、明らかに管樹の一部ではない明るい信号を画像に残すことができます。場合によっては、ここに見られる真の信号は背景と同じくらい暗く、画像から簡単にしきい値を取り除くことができます。より正式なレンディションは、対象領域のセグメンテーションを可能にするより高度な解析ソフトウェアを使用して行うことができます。
注入された乳管樹の最良の表現を得るために、さらなる画像処理のために乳脂肪パッドをセグメント化することが最善である。乳脂肪パッドの暗い境界は、このセグメンテーションを達成するために、動物の完全な厚さにわたってスプライントレースされ得る。3 つのスライスごとにトレースし、オブジェクトを伝播するだけで、私たちの経験ではダクト全体をキャプチャできます。
この時点で、所与の怒りを用いてレンディションを閾値化し、乳脂肪パッド内に含まれるコントラストのみを表示することができる。これには、ダクタルツリー内のソリューションと、すぐ近くの漏れを含める必要があります。酸化タンタル溶液は、一般に300〜3000HUの範囲で良好に表示される。ダクタルツリーの再構築を作成したら、さらに分析を行うことができます。
縦方向の画像化が望ましくない場合は、管樹の複雑な構造をよりよく捉える高解像度の画像を取得してもよい。動物間の違いは、注射を多かれ少なかれ困難にする可能性があります。現在、スプレイグ・ドーリーのラットのみを扱っているため、株から株への変動性について話すことはできません。
一部の動物は、ここに描かれているような目立たない乳首を持っているため、カニューレ挿入を操作して成功させることが困難になります。他の人は、ここに示されているような、より高いプロファイルの乳首を持ち、カニューレ挿入により適しています。正常にカニューレ挿入された乳首がここに描かれています。
カニューレ挿入が困難な場合、ここに示すように乳首に外傷を引き起こす可能性があります。注入直後のマイクロCT画像の取得は、注入の成功を研究者に知らせるだけでなく、特定の溶液の充填特性を特定するのに役立ちます。ここでは、100ミリモルの酸化タンタルによって提供される対照的に、70%エタノールを含む同じ量の切除液を注射した同じラットの腹部腺のさまざまな側面が見られます。
示されている上部腺で使用された溶液には、1%エチルセルロースも含まれていました。管枝の端に壁のような構造が見えます。これらは、溶液で満たされ、こぼれない末端の芽です。
一番下の行には、ダクタルツリーからの溶液の脱出を示す、あまり定義されていないダクタルエンドが表示されます。これは、組織学的検査におけるより限定的な付随的損傷とともに。乳管樹へのエチルセルロースを含む溶液のより良い保持を示すようです。
この方法は、乳がん予防の低侵襲方法のスケーラビリティに向けた一歩を提供し、予防的乳房切除術の代替手段を提供します。より大きなげっ歯類モデルでの上皮アブレーションの成功は、動物への副作用を最小限に抑えて実証されています。アブレーション溶液にエチルセルロースを添加すると、注射領域への溶液の保持が改善され、巻き添え被害が減少します。
臨床的に証明されたソリューションの斬新な使用と、一般的なイメージングモダリティで送達の成功を視覚化する機能を追加することで、すぐに臨床に翻訳することができます。
