この方法は、微小環境が腫瘍の成長をどのようにサポートするか、または特定の薬物が乳癌の進行を効果的に阻害できるかどうかについて、がん分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。腫瘍誘導技術の主な利点は、手術が必要なく、その場で乳癌を確立するための侵襲性の低い方法であるということです。この技術を用いて、腫瘍細胞は乳腺脂肪パッド内で増殖し、適切な組織環境において、マウス細胞への皮下注射または異種移植よりもヒト乳癌の進行をより密接に模倣する。
技術者のKe-Xin Caoと私は、この手順をデモンストレーションする際に、ガンリン・ザンを支援します。手術の前日に、手動でレシピエントマウスを拘束し、動物の腹側を毛皮に向けて4番目の乳首の周りに剃ります。脱毛クリームの薄い層で毛皮を拭きます。
蒸留水を使用して30〜60秒後にクリームを取り除き、柔らかいペーパータオルでマウスを乾かします。手術当日、マウス乳癌細胞懸濁液を、PBS濃度のミリリットル当たり5番目の細胞を氷上の滅菌マイクロ遠心分離管で20倍から5番目の細胞に希釈する。各注射の前に、1つのマウスにつき50マイクロリットルの細胞を備えた1ミリリットルの注射器を45%16針で装着した。
そして、各鎮静動物のつま先ピンチに対する応答の欠如を確認してください。動物の目に軟膏を塗布し、ピンセットを使用して最初のマウスの4番目の乳首の周りに皮膚をテントに入れ、シリンジが従うトンネルを作ります。ベベルを上向きにして注射器を持ち、針先が乳首に届きそうになるまでトンネルに続いて、乳首から5〜10ミリメートルで皮に皮を皮下に入ります。
ピンセットを使用して最初の乳首の周りの皮膚をテントに入れるので、注射器が続くトンネルが作られます。針はピンシーツチップの間に入る必要があり、組織に落ち込むのではなく上げる必要があります。ベベルが乳首の下になるまで針の先端を乳腺脂肪パッドに慎重に上げ、皮膚テントを離して癌細胞のゆっくりとした注射を可能にする。
挿入時に、ベベルが乳首の下になるまで慎重に針先を乳腺脂肪パッドに上に移動します。そして、あなたは正しい場所に細胞の配信を確実にするために抵抗を感じるでしょう。すべての細胞が注入されたら、針を少し横に回し、注射器をゆっくりと引き込みます。
綿棒を使用して針の傷口に10〜20秒間圧力をかけ、流体の浸透をなくします。注入されたニップルは、中央に乳首を持つ透明、白、平らな球として表示される必要があります。腫瘍の容積を確立するには、マウス腹側を拘束し、キャリパーを使用して腫瘍の長さと幅を測定する。
腫瘍の生物発光を捕捉するために、画像化の10分前にマウスの首の後ろに1キログラム当たり150ミリグラムのD-ルシフェリンを注入する。そして、適切な生物発光イメージングパラメータの下で原発腫瘍および転移の生物発光画像を捕捉する。適切な実験時点で、はさみを使用して皮膚から腫瘍を収穫する。
そして、手術後の痛みを和らげるために、鎮痛液を外科部位に塗布する。その後、標準的なプロトコルに従って外科縫合糸で皮膚を閉じます。完全な回復まで監視と温暖化ランプの下で動物が回復することを許可します。
メスを使って原発腫瘍を2つの等しい部分に切り分けます。その後のヘマトキシリンおよびエオシン染色および免疫組織化学のために、組織の半分を4%パラホルムアルデヒドに保存する。残りの半分を液体窒素で凍結し、ウェスタンブロッティングまたはRNAi分離を行います。
適切な実験エンドポイントでは、標準的な解剖プロトコルに従って肺を収穫し、PBSで臓器を洗浄する。その後、4%パラホルムアルデヒドで肺を固定し、ヘマトキシリンとエオシン染色による転移を確認します。原発性腫瘍の増殖は、実証されるように、腫瘍量および生細胞生物発光によって測定することができる。
転移は、二次腫瘍が確立されていないか、または原発性腫瘍の強い生物発光シグナルが弱いシグナルを有する小さな転移性病巣の検出を妨げるかのいずれかとして、接種の初期段階では観察されない。切除後、遠くの器官の転移性病巣からの生物発光シグナルを検出し、分析することができる。ヘマトキシリンおよびエオシン染色による原発性乳房腫瘍および肺切片の両方の形態の分析は、抗CD31マイクロ血管マーカー染色によって証明されるように腫瘍細胞接種動物における血管新生の増加を明らかにする。
この手順を試みる場合は、腫瘍細胞を送達する前に針先が正しい位置にあることを覚えておくことが重要です。この手順に従って、アトマイザーは、動物の超音波のような、生体内の原発性腫瘍の膀胱補充に関する追加の質問に答えるために行うことができる。その開発後、この技術は、腫瘍形成の分野の研究者のための道を開き、マウス動物モデルにおける腫瘍形成に関与する重要な要因と経路および抗癌薬のメカニズムを探求する薬の開発。
isofluraneまたは他のガス麻酔での作業は、非常に投与が困難であり、活性炭マスクを使用するなどの予防措置は、常にこの手順を実行しながら取られるべきであることを忘れないでください。
