このプロトコルは40年以上使用されており、ラットの乳腺細胞移植アッセイの唯一の信頼できる方法です。この方法は、乳がん感受性研究における乳腺細胞自律対宿主効果を問い取るために広く使用されている。この方法は、肩間脂肪パッドで移植することにより、ラットに有効でない内因性膜上皮をクリアする必要がある。
したがって、この方法は侵襲性が低く、内因性乳腺を内部制御として使用することができる。この手順を開始するには、安楽死させた雌のラットを背中に置き、ピンで固定します。腹側表面全体に70%エタノールをスプレーします。
矢状のY字型切開を行い、胸部、腹部、およびインギナル乳腺へのアクセスを可能にする。ドナーラットからすべての乳腺組織を解剖し、目に見えるすべてのリンパ節を除去するためにはさみを使用してください。次に、鉗子を使用して乳腺組織を抽出する。
500マイクロリットルの無血清DMEM F12培地を含むラベル付き60ミリメートル皿に入れ、氷の上に保管します。その後、はさみを使用して乳腺組織を細かくミンチします。まず、ドナー動物の体を慎重にひっくり返して、それを起こしやすい位置に置き、ピンで固定します。
ヘッドと上部の背部に70%エタノールを吹き付けます。頭蓋骨の基部を見つけ、後頭部コンディルの下に切開を行い、皮膚の下に鋭いはさみを挿入し、頭の側面を含む頭蓋骨から皮膚を切り取ります。次に、骨カッターまたは強いはさみを使用して、後頭部から前頭骨に沿って頭蓋骨を切断し、ブレードを可能な限り表面的に保ち、基礎となる脳組織の破壊を防ぐために上向きに傾けます。
骨を剥がすために、ロンガまたは強い鉗子を使用してください。小脳にツールを横に挿入して、両側の骨を折ります。完全に聴覚運河を露出させることによって髄液への接続を切断します。
頭蓋骨から脳を持ち上げ、その重量を記録するために湾曲した細かい先端の鉗子を使用してください。追加のドナーの脳のための供給の新しいスタートを使用してください。すぐに氷の上に保存されているメディアの同じ量を含む15ミリリットルのチューブにそれを転送します。
低速で10〜15秒間脳を均質化します。次に、ホモジュネートをフィルターして大きな部分を取り除きます。必要になるまで氷の上に液体を保管してください。
まず、1,000マイクロリットルのピペットチップの端から1センチメートルを切り取り、手動でピペットの上に置きます。カットピペットチップを使用して、各60ミリメートル皿からコラゲターゼ消化管にひき肉ドナー組織を移します。みじん切り組織を1~2回上下にピペット化して軽く混ぜます。
次に、振盪インキュベーター内の水平位置にサンプルを固定します。200~220RPMの速度で振りながら、37°Cで1.5~2時間消化します。ドナー乳腺組織が完全に消化されると、懸濁液を1,200倍g、摂氏4度で10分間遠心分離する。
ペレットが形成されたことを確認した後、ピペットを使用して脂肪層を取り除くか、上清を慎重に注ぎます。新鮮なDMEM F12培地の10ミリリットルにペレットを静かに再懸濁します。このプロセスを繰り返して、細胞を完全に洗浄します。
すべてのドナー動物のための40マイクロメートルのストレーナーと1つの50ミリリットルの管を準備する。DMEM F12培地の少なくとも1ミリリットルでストレーナーを予湿する。次に、ピペットを使用して細胞懸濁液をフィルターを通して、管状の断片またはオルガノイドを収集します。
オルガノイドの場合は、フィルターに残っている細胞のみを保持します。新しい50ミリリットルチューブ上の細胞ストレーナーを反転し、すべての細胞を収集するために必要な無菌培地の任意のボリュームですすいでください。この後、細胞をもう一度ペレットし、カウント用の少量の培地で再懸濁する。
移植の各部位に対して50%の脳ホモジネートと細胞懸濁液の等しい量を組み合わせることによって、すべての移植の受容者のためのドナー材料の単一のバッチを準備する。まず、レシピエント動物の頭蓋骨の基部と椎骨柱の始まりを特定する。背骨の下の約3分の1は、背中の上部胸部に3センチメートル2センチメートルの領域を剃る。
次に、手術に使用される無菌フィールドを準備し、必要なすべての物資を手配します。細胞の損失を防ぐために、無菌DMEM F12メディアでハミルトン注射器を洗い流します。各条件に対して、ドナー材料の全容を別々のシリンジにロードします。
注射器を完全に装填した後、それを反転し、針の先端にある気泡を取り除くためにプランジャーをわずかに押します。手順を通して氷の上に注射器を保管してください。動物がしっかりとつま先のピンチで深い刺激に反応しないことを確認します。
その後、鋭い外科用ブレードを使用して、小さな肩甲間切開を行います。方向のための内側血管を見つけ、切開の片側の皮膚を持ち上げるために鉗子を使用する。脂肪パッドから離れて皮膚を保持し、移植が行われている間、下層の茶色の脂肪を避けます.
次に、針を移植部位に挿入する。慎重に細胞混合物の40マイクロリットルを間肩白色脂肪パッド組織に注入する。針をゆっくり取り外します。
組織を所定の位置に保持し、移植した細胞が3〜5秒間落ち着くようにします。移植の第2の部位で前述したように、全体の注入手順を繰り返す。この後、創傷クリップまたは縫合を使用して外科的創傷を閉じ、麻酔を中止する。
動物を犠牲にした後、解剖のためにそれを準備します。肩甲間脂肪パッドの移植部位を分離する内側血管を特定します。パッド全体をティッシュの一部として物品物品切り出し。
ティッシュを正に帯電した顕微鏡スライドに置き、全体のマウントを行います。スライドを70%エタノールに7〜10日間入れ、組織の脂肪を取り出します。その後、ミョウバンカルミン染色を調製し、組織が十分に不透明なときにスライドを処理します。
処理が完了し、スライド上の組織がクリアされたら、低出力光顕微鏡または高解像度のデジタル写真を使用して、分析のためにスライドの画像を取得します。本研究では、乳腺上皮細胞を、ドナーラットからの単離された乳腺上皮オルガノイドがレシピエントラットの肩甲骨白色脂肪パッドに移植されるラットの働きに最適化された技術を用いて移植される。上皮の存在、不在、または存在量を評価して、実験の成功と実験変数に関連する効果の自律性を決定することができる。
各因子が野生型とノックアウトなどの2つのレベルを有する相互移植実験は、仮説テストのための4つの移植群を作成する。代表的な全体の座付け間肩用脂肪パッドは、移植の両方の部位で陽性の上皮の成長を含んでいます。スライドを分析する際、多くのサンプルにわたる肩間脂肪パッド内の上皮の欠如は、手順に技術的な問題があることを示し、否定的な結果として扱われるべきである。
ドナー上皮の成長はまた内因性乳腺と比較することができ、追加の結論を促進するかもしれない。ここに示す例では、野生型およびCDKN1Bノックアウトラットを用いた相互移植の結果は、乳腺の発達に対する非乳腺細胞自律的効果を示唆した。ドナー上皮細胞およびオルガノイドは、慎重に調製し、レシピエント動物に注入されるまで生き続けなければならないことを覚えておいてください。
事前に計画を立て、慎重に、中断することなく手順を実行することが不可欠です。原発癌アッセイは、乳癌の病因または治療における乳腺細胞の自律性を問い合わすために移植後に行うことができる。遺伝子編集はまた、ドナー細胞またはレシピエントラットを遺伝子操作するために組み込むことができる。
ラットにおける乳腺上皮細胞移植を行う唯一の方法として、この手順は乳腺の発達ならびに発癌研究を促進する。この技術は、乳がん細胞および/または乳腺上皮細胞と宿主微小環境との相互作用を研究する上で特に重要である。乳がん研究だけでなく乳腺の開発の研究も可能にします。
この技術を初めて試みる人は、ドナー細胞の調製物を最適化して最大の細胞収量と生存率を確保し、手術手順を練習し、注入する細胞番号を決定し、実験に必要な手術後の潜伏時間を決定する小さなパイロット実験を行う必要があります。
