このプロトコルは、研究者が乳腺上皮細胞の異なるサブセットからヒト乳癌の発達を再現するための新しいタイプのマウスモデルを生成するのに役立ちます。この技術により、研究者は、細胞型特異的な方法で、広範なマウスの繁殖を必要とせずに、発達段階組織の乳癌マウスモデルを生成することができます。この手順を開始するには、テキスト プロトコルで説明されているように、floxed マウスを生成、維持、および麻酔します。
手術を行う場所とは別の領域にマウスを持って来なさい。つま先ピンチを行うことによって麻酔を確認した後、手術手順の準備のために1キログラム当たり5ミリグラムの用量で鎮痛皮としてメロキシカムを皮下注射する。脱毛クリームの数滴を適用することにより、乳首の外科部位を公開します。
柔らかいペーパータオルを使って、余分なクリームやゆるい髪を取り除きます。乳首の損傷を避けるためにシェービングは推奨されません。手術部位をヨードファーで消毒し、最初に70%アルコールを摂取し、最終的にスクラブヨードファーを塗布して終了します。
ガーゼスポンジまたはコットンチップアプリケータを使用して、作業領域の中心から周辺に向かって円形の動きで行います。サイクルを 3 ~ 4 回繰り返します。外科処置を通して無菌の技術を使用する。
2つの第4のりがれた乳腺の間の約1センチメートルの長さで皮膚に切開部位を作る。乳腺管の木を見えるように、皮膚のフラップを頭頂部腹膜から慎重に分離する。慎重に時計職人の鉗子で乳首を保持し、マイクロ解剖ハサミを使用して近くの皮膚を切断することなく、外装乳首を取り除きます。
33ゲージの金属ハブニードルを取り付けた25マイクロリットルのハミルトン注射器に、約3〜5マイクロリットルのクレデノウイルス注射混合物をロードします。注射器中の注入混合物の体積を、混合物に含まれる青色染料に基づいて推定する。細かい湾曲したツイーザーで皮膚フラップの端を静かに保持し、乳腺管の木への青い染料の広がりを監視しながら、クレ・アデノウイルス注入混合物をゆっくりと乳首に注入する。
ダクタルーメンの損傷を避けるために、注射速度をできるだけ遅く維持してください。正常な内管内注入は、間質コンパートメントに漏れることなく、管全体の木全体に広がる注入された液体によって示される。注射液の漏れを避けるために、乳首から針をそっと引き出します。
乳腺の遠位または注射された乳首の周囲の領域を調べます。ここに示すように近くの間質に拡散染料は、正常な内管内注射ではなく、乳腺脂肪パッド注射を示しています。傷のクリップで皮膚の外科的創傷を閉じます。
麻酔からマウスを取り出し、回復のためにきれいなケージの中の加熱パッドの上に置きます。テキストプロトコルに記載されているように、乳腺腫瘍の発達を監視します。最も若い雌マウスの中で、インダクタル注射が成功する可能性があるのが、およそ3週齢のマウスである。
ほとんどの乳腺腫瘍誘導実験では、若年成人雌マウスが用いられる。より大きな量の注射混合物を伴う導管内注射は、歯槽細胞を標的とする妊娠初期から中期の雌マウスにおいて行うことができる。乳腺腫瘍誘導のための異なる乳腺上皮細胞亜集団を標的とするために、異なる乳腺上皮細胞サブセットの制御下にあるCre-adenovirusウイルスは、注射に使用された。
例えばケラチン8プロモーターの制御下でクレ・アデノウイルスを使用して、ルミナル乳腺上皮細胞を標的とした。ケラチン5プロモーターの制御下でクレ・アデノウイルスは、基底乳腺上皮細胞のみの遺伝的マーキングにつながる基底系統を標的とした。女性のP53フロクスホモ接合マウスにROSA26-YFPレポーターを用いた場合、ケラチン8クレデノウイルスの内因性注射により、注射の数ヶ月後に乳腺腫瘍が発症した。
条件付きR26-Yレポーターが含まれているため、腫瘍上皮細胞は通常YFPによってマークされ、フローサイトメトリーによって検出することができた。細胞は、さらなる分析のためにYFP陽性細胞のフローソートによって濃縮することができる。この手順を試みる際に覚えておくべき最も重要なことは、少量の注入量を使用して、ゆっくりと注入し、また、ゆっくりと針を引き出すことである。
この手順に従って、1つは、注射された腺のフローサイトメトリーまたは共免疫蛍光染色によって、標的YFP陽性乳腺上皮細胞の前悪性および癌段階への進行を監視することができる。この技術は、研究者が乳癌の起源の細胞、それらが異なる自己原性事象にどのように反応するか、そしてそれらが癌細胞にどのように進行するかを研究する道を開くでしょう。アデノウイルスと注射針の両方が潜在的に危険です。
したがって、常に手袋を着用し、眼内注射を行う際には安全針と注射器を使用する必要があります。
