このプロトコルでは、48の細菌分離株上の2つのC.elegans株において、C.elegans酸化熱ストレス耐性に影響を与える細菌を並行してスクリーニングする方法について説明しています。このアプローチは用途が広くスケーラブルです。これは、健康に対するC.elegansに影響を与える複数の状態の迅速なスクリーニングを提供し、健康と病気のメカニズムの研究に適用できます。
ストレス耐性を健康の代用として使用するこのパイプラインは、線虫変異体、ノックダウン、トランスジェニック、および疾患モデルでの薬物、制吐薬、およびプロバイオティクスの前臨床スクリーニングに容易に適用できます。多くの条件を並行してテストする能力は、関与し、生理学的プロセスに役立つ複雑な相互作用の研究を可能にします。これらには、宿主微生物の相互作用、代謝障害、ストレス処理、および老化が含まれます。
全体を通して汚染を避けることが重要です。ワームが食物を使い果たさないようにし、ワームが必要な段階に達したらすぐに重要な手順を実行してください。濃縮大腸菌OP50細菌培養物の調製から始め、1リットルのリゾジェニーブロスボトル4本にそれぞれ2ミリリットルのOP50スターター培養液を接種します。
次に、ボトルを摂氏37度と160 Gで6時間振とうインキュベーターに入れ、続いて細菌を3057 Gと摂氏20度で15分間ペレット化します。その後、上清を廃棄し、ペレットを6ミリリットルのOP50培地で再懸濁します。濃縮培養物を滅菌50ミリリットルの円錐管に集める。
1株あたり8枚の6センチメートルNGMプレートに、プレートあたり摂氏37度で一晩増殖させた100マイクロリットルの飽和OP50培養液を接種します。その後、プレートを摂氏20度に2日間保管してから使用してください。次に、メスを使用して、最近飢えたNGMプレートからのワームで0.5センチメートルの正方形の寒天チャンクを切り取り、接種された8つの6センチメートルのNGMプレートのそれぞれに移します。
これらのプレートを摂氏20度で3日間インキュベートします。次に、P1000ピペットを使用して6センチメートルのNGMプレートに最大3ミリリットルの滅菌Mナインバッファーを加えてワームを再懸濁し、1つの15ミリリットルのコニカルチューブで1株あたり8つのプレートすべてからワーム溶液を回収します。次に、摂氏4度で142倍Gで2分間遠心分離し、P5000ピペットまたは滅菌パスツールピペットまたはチップを備えたウォーターポンプを使用して上清を慎重に除去します。
その後、10ミリリットルの滅菌M 9バッファーを加えて、ワームペレットを洗浄します。次に、上清を取り除き、ピペットを使用して濃縮OP50を添加した15センチメートルのOP50接種NGMプレートにワームを移します。直径15センチメートルのNGMプレート上で、摂氏15度で3〜4日間、毎日0.5ミリリットルの濃縮OP50をワームに再給餌することにより、各ワーム株を増殖させます。
M nineバッファーを採取して洗浄した後、各ワーム株培養物をより多くのNGMプレートに移し、人口の95%が妊娠した成虫になるまで摂氏20度でワームを繁殖させます。次に、標準的な卵の準備方法に従って妊娠した成虫を漂白し、卵を播種していない2つの15センチメートルのNGMプレートに摂氏15度で24時間移して、すべてのL1幼虫が孵化し、後続のステップで同期して成長できるようにします。まず、6センチメートルのLB寒天プレート上で以前に増殖したすべての細菌塊を収集し、1ミリリットルのMナインバッファーを含むラベル付きの1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。
次に、細菌ペレットが完全に再懸濁されるまで、マイクロ遠心チューブをボルテックスします。次に、室温で5分間9, 300倍Gでスピンダウンし、700マイクロリットルの上清を除去します。再びボルテックスによって細菌ペレットを再懸濁する。
続いて、各細菌懸濁液200マイクロリットルを空の滅菌96ウェルプレートの単一ウェルに移す。このプレートから、マルチチャンネルピペットを使用して8枚の96ウェルNGMアガロースプレートに10マイクロリットルの細菌溶液を接種し、蓋をした状態で摂氏25度で24時間インキュベートします。その後、96ウェルのサスペンションプレートを清潔な粘着天井フィルムで密封し、摂氏15度で最大5日間保管します。
まず、プレートを見て、同期したワーム集団の発生段階を評価します。ワームの90%以上がL 4段階に達したら、15ミリリットルの円錐形チューブに最大10ミリリットルの滅菌M 9溶液でワームを収集します。次に、摂氏4度で2分間142倍Gでスピンダウンし、各洗浄の間に10ミリリットルの新鮮な滅菌Mナインを加えてOP50細菌を取り除き、ワームを4回広範囲に洗浄します。
その後、上清を除去し、ワームペレットを10ミリリットルのM 9に再懸濁する。50マイクロリットルのワーム溶液を、950マイクロリットルのM nineを含む1.5または2ミリリットルの低表面結合チューブに移します。ワームの沈降を避けるためにチューブの内容物を穏やかに混合した後、濡れた低結合ピペットチップをすばやく使用して、3〜4個の別々の10マイクロリットルの滴をスライドガラスまたはNGMプレートに移します。
16倍の倍率の実体顕微鏡下で、ワームの数を数え、3〜4滴のカウントを平均して、ワーム溶液中のマイクロリットルあたりのワームの数を決定します。15ミリリットルの円錐管でワーム濃度をマイクロリットルあたり15ワームに調整します。次に、マルチチャンネルピペットまたはリピートピペットを使用して、8マイクロリットルのワーム溶液を8つの96ウェルNGMアガロースプレートの各ウェルに移します。
36時間後、30マイクロリットルのM 9を96ウェルプレートの各ウェルに分注する。次に、低保持チップを使用して、設定されたレイアウトに従ってワームを384ウェルプレートに移し、プレートリーダーが正しくセットアップされていることを確認します。その後、384ウェルプレートにさらにM nineを補充し、熱ストレスアッセイ用に40マイクロリットルのM nineを、TBHP誘発酸化ストレス用に6マイクロリットルのTBHPに34マイクロリットルのM nineを追加することで、ウェルあたり60マイクロリットルの最終容量を目指します。
その後、TBHPを追加してから2分以内にアッセイを開始します。次に、透明な蓋でプレートを閉じ、384ウェルプレートの端をマスキングテープで密封し、テープが蓋の上やプレートの下に入らないようにします。次に、プレートをプレートリーダーに挿入します。
ピークがノイズと有意に異ならない蛍光値を決定し、蛍光変動が上昇する前に減衰する最も早い時点をメモします。次に、最小蛍光値と最大蛍光値がカーブフィットに使用されると予想される時点に注意してください。その後、蛍光ピークの振幅がウェル間で有意に異なるかどうかを確認します。
原稿に記載されている式を使用して、さらに分析する前にデータを正規化します。まず、GitHub から LFASS をダウンロードし、MATLAB を起動して LFASS フォルダーに移動します。次に、画面の指示に従って、コマンドウィンドウにfitフォルダーを入力して実行します。
フィットフォルダに入力した後、Excelファイルが配置されているデータフォルダの名前をマイデータとして入力します。次に、現在のプロトコルで連続する測定間の時間間隔に2を入力し、ノイズしきい値を入力します。次に、「0.94」と入力して上側公差しきい値を割り当て、「0.06」と入力して下側公差しきい値を割り当てて、シグモイド適合を拘束します。
時間間隔を設定して、最大値と最小値を見つけます。収束フィットを視覚的に検査するには、プロンプトが表示されたときにフィット曲線と滑らかな曲線を表示しない場合は、はいの場合はY、いいえの場合はNを入力します。次に、再調整を試みるための新しい時間境界、下限時間、上限時間境界を指定します。
再取り付けを試みる場合は、2 と入力します。ただし、再取り付けを受け入れて次のカーブに進む場合は、ゼロと入力します。ノイズとして識別されたカーブを解析するか、適合不良のカーブを再適合するかを選択するには、Yを入力して承認し、Nを入力して拒否します。
残りのすべてのカーブに対して再フィットが試行または拒否されると、プログラムは終了します。結果フォルダーから結果ファイルを取得し、ダウンストリーム分析用にドットXLSXとして保存します。熱および酸化ストレス耐性アッセイは、MYB11またはMYB115細菌分離株または大腸菌OP50対照細菌のいずれかを食べさせたブリストルN2つの野生型ワームに対して実施されました。
36時間後、成虫の野生型ワーム集団は、摂氏42度の熱ストレスと7%TBHP誘発酸化ストレスにさらされました。死亡時間の中央値は、熱ストレスアッセイでは40〜130分、酸化ストレスアッセイでは90〜240分の間で変化した。ステップ2.5でワームが増殖し、ステップ2.1に最大2時間かかることを確認するには、ステップ4.6で96ウェルプレートから284ウェルプレートにワームを準備するプレートレイアウトを描きます。
ステップは追加または置換できます。例えば、宿主ゲノムワイドRNAスクリーニングまたは細菌遺伝子スクリーニングは、それぞれRNIクローンまたは細菌変異体を腸内細菌分離物に置き換えることによって実施することができる。そのため、現在、このアプローチを使用して、新しいプロバイオティクスを特定し、感染症や老化の文脈で宿主のマイクロ相互作用に関与する遺伝子制御ネットワークを明らかにしています。
